| License: Creative Commons Attribution 4.0 (4MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-400892
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.40089
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 8 May 2020 |
| Referee: | Prof. Dr. Marina Kreutz |
| Date of exam: | 9 April 2019 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie) |
| Keywords: | CD8 T cells, Effektorfunktionen, Metabolismus, Tumor |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 40089 |
Abstract (English)
Novel, promising strategies to fight cancer include immunotherapeutic approaches these days. Such strategies are regarded as breakthrough of the 21th century. The Nobel Prize of medicine was recently awarded to the discovery of ways to remove the immune system’s “brakes” (checkpoints) and thereby unleashing immune cells to attack tumors. However, only in a limited cohort of patients a persisting ...
Abstract (English)
Novel, promising strategies to fight cancer include immunotherapeutic approaches these days. Such strategies are regarded as breakthrough of the 21th century. The Nobel Prize of medicine was recently awarded to the discovery of ways to remove the immune system’s “brakes” (checkpoints) and thereby unleashing immune cells to attack tumors. However, only in a limited cohort of patients a persisting tumor regression is achieved. Besides avoiding immune recognition by the expression of such checkpoint molecules or the lack of antigen presentation, the metabolic tumor microenvironment contributes to diminished anti-tumor immune responses. The tumor microenvironment is characterized by low levels of nutrients and at the same time the accumulation of immunosuppressive metabolites as lactic acid, both negatively affecting the anti-tumor immune response. Therefore, targeting tumor metabolism could improve the efficacy of immunotherapeutic approaches. The link between metabolism and T cell effector functions is still a matter of debate and data on the human system are rather sparse particularly for different CD8 T cell subsets. Understanding this link is a prerequisite for the development of therapies targeting tumor cells, but preserving immune cell functions.
Thus in this thesis, CD8 T cell subsets (naïve, central and effector memory T cells) were characterized in terms of their metabolic demands for different aspects of function as proliferation or cytokine secretion. Nutrient restriction experiments were performed to reveal metabolic dependencies of CD8 T cells and finally the impact of anti-metabolic drugs as proposed for cancer treatment was analyzed.
In comparison to murine T cells, human CD8 T cells seem to be less dependent on glucose metabolism, as cell growth and effector functions as cytokine secretion were only slightly compromised under glucose deprived conditions. However, proliferation was blocked in all three subsets. Interestingly, the variation between donors was pretty high especially in naïve T cells.
In contrast, glutamine was essential for CD8 T cell function as glutamine restriction led to insufficient activation of all CD8 T cell subsets. Nevertheless, effector functions as IFNγ and TNF secretion were less compromised under glutamine deprived conditions in memory subsets than in naïve T cells. Titration experiments showed that glutamine concentrations as low as 0.1 mM inhibited T cell activation and IFNγ and TNF secretion, a concentration which has been already detected in tumors. Proliferation was already significantly reduced at a glutamine concentration of 0.25 mM. These results showed that not only glucose but also glutamine is a substrate, tumor cells and immune cells have to compete for in the tumor microenvironment. Experiments failed to find a combination of metabolites downstream of glutamine degrading pathways which can substitute for glutamine, indicating that glutamine itself is crucial for T cells. Preliminary results suggest that the lack of glutamine synthetase, an enzyme catalyzing the reaction of glutamate to glutamine, could play a role in the dependency on glutamine in T cells.
Next, the role of cellular respiration was analyzed by application of oligomycin, an ATP synthase inhibitor. T cell functions as proliferation as well as IFNγ and TNF secretion were diminished in naïve T cells but only slightly in central and effector memory T cells.
Although effector memory T cells are regarded as an exhausted subset, our findings suggest that these cells are less affected by nutrient restriction than naïve T cells. Therefore also effector memory T cells should be considered in terms of immunotherapeutic approaches as adoptive T cell transfer.
Finally, as activated T cells show an accelerated metabolism similar to tumor cells, the impact of anti-metabolic drugs was investigated in freshly stimulated CD8 T cells. With special regard to adoptive T cell transfer, the impact of clinically relevant anti-metabolic drugs was investigated in expanded CD8 T cells.
Due to the importance of glutamine for T cell activation, the application of inhibitors targeting glutamine metabolism has to be considered carefully. Due to this fact the impact of glutamine analogues (DON and acivicin) as well as glutaminase inhibitors (BPTES and CB-839) was analyzed in this study. Inhibition of glutaminase, converting glutamine to glutamate, had no impact on T cell function in primary stimulated CD8 T cells, whereas the glutamine analogs strongly impaired T cell function and metabolic activity. Surprisingly, DON did not show a strong impact on expanded CD8 subsets.
Since glucose metabolism is of major importance for tumor cells, the impact of drugs targeting glycolysis on T cells was analyzed. Inhibition of monocarboxylate transporter (MCTs) in tumor cells, to block lactic acid secretion, affects tumor cells itself but might also support the anti-tumor immune response by reducing lactate accumulation. Up to now potent MCT inhibitors have been developed only for MCT1 and MCT2. The two non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) diclofenac and lumiracoxib, both known cyclooxygenase (COX) inhibitors, target MCT1 and MCT4. As they are the only identified inhibitors of MCT1 and simultaneously MCT4, they might be promising substances in the context of tumor therapy. Although an inhibition of glycolytic activity was observed, cytokine secretion was maintained in human naïve and effector memory CD8 T cell subsets and also in expanded CD8 T cell subsets. Only a reduction in proliferation was observed after six days. These results were further supported by investigating a complete MCT1 and MCT4 inhibition in murine T cells. To mimic this pan-MCT inhibition, MCT4 deficient T cells were cultured in the presence of a MCT1/2 inhibitor. Although the glycolytic activity was almost completely blocked, murine T cells were still able to secret important effector cytokines such as IFNγ; however levels were moderately reduced.
In this thesis, CD8 T cells showed subset specific differences in their metabolic activity. While glucose restriction did not harmed T cell function, glutamine deprivation had a strong impact on the T cell immune response. Therefore, targeting glucose metabolism is a promising strategy in cancer therapy, while drugs acting on the glutamine metabolism have to be considered carefully. Nevertheless, T cells were unaffected by glutaminase inhibitors. These findings suggest that anti-metabolic drugs are promising supplements in immunotherapeutic approaches as checkpoint blockade or adoptive T cell transfer therapy.
Translation of the abstract (German)
Immuntherapeutische Ansätze stellen heutzutage neuartige, erfolgsversprechende Strategien zur Krebsbehandlung dar. Diese neuen Vorgehensweisen gelten als Durchbruch des 21. Jahrhunderts. So wurde kürzlich der Nobelpreis für Medizin für die Entdeckung verliehen, „die Bremsklötze“ des Immunsystems (sogenannte Checkpoints) zu lösen und dadurch Immunzellen zur Tumorbekämpfung zu befähigen. Allerdings ...
Translation of the abstract (German)
Immuntherapeutische Ansätze stellen heutzutage neuartige, erfolgsversprechende Strategien zur Krebsbehandlung dar. Diese neuen Vorgehensweisen gelten als Durchbruch des 21. Jahrhunderts. So wurde kürzlich der Nobelpreis für Medizin für die Entdeckung verliehen, „die Bremsklötze“ des Immunsystems (sogenannte Checkpoints) zu lösen und dadurch Immunzellen zur Tumorbekämpfung zu befähigen. Allerdings wird eine andauernde Tumorregression durch eine solche Therapie nur in einer begrenzten Patientengruppe erreicht. Neben der Tatsache, dass Immunzellen aufgrund solcher Checkpoints und einer fehlenden Antigen-Präsentation den Tumor nur unzureichend erkennen, trägt das metabolische Tumormikromilieu zu einer verringerten anti-tumoralen Immunantwort bei. Das Tumormikromilieu ist nämlich durch einen Nährstoffmangel und gleichzeitig einer Anhäufung immunsuppressiver Metabolite gekennzeichnet, wie beispielsweise der Milchsäure, was die anti-tumorale Immunantwort abschwächt. Daher könnte die Erfolgsquote einer Immuntherapie durch das Eingreifen in den Tumormetabolismus gesteigert werden. Der Link zwischen Metabolismus und humanen T-Zell-Effektor-Funktionen ist immer noch unzureichend geklärt, wobei es an Untersuchungen zum humanen System mangelt, vor allem in Bezug auf Daten für verschiedene CD8 T-Zell-Subpopulationen. Diesen Link zu verstehen ist essentiell für die Entwicklung neuer Therapieansätze, bei denen gezielt Tumorzellen bekämpft, gleichzeitig aber T-Zell-Funktionen erhalten bleiben.
Deshalb wurden in dieser Arbeit die metabolischen Anforderungen charakterisiert, die für die Aufrechterhaltung von Funktionen, wie Proliferation oder Zytokinproduktion, in CD8 T-Zell-Subpopulationen (naive Zellen, zentrale und Effektor-Gedächtniszellen) nötig sind. Mit Hilfe von Nährstoffentzugs-Experimenten wurde die metabolische Abhängigkeit von CD8 T-Zellen untersucht und zudem der Einfluss von anti-metabolischen Substanzen analysiert, die in der Krebsbehandlung Anwendung finden könnten.
Im Vergleich zu murinen T-Zellen, schienen humane T-Zellen weniger auf den Glukosemetabolismus angewiesen zu sein, da das Zellwachstum und die Effektor-Funktionen, wie die Zytokinproduktion, nur leicht durch einen Glukoseentzug beeinträchtigt waren. Allerdings wurde die Proliferation in allen drei Subpopulationen inhibiert. Interessanterweise war vor allem in den naiven T-Zellen eine hohe Spendervarianz zu beobachten.
Im Gegensatz dazu war der Glutaminstoffwechsel essentiell für die Funktionen der CD8 T-Zellen, da ein Glutaminentzug zu einer unzureichenden Aktivierung in allen Subpopulationen führte. Allerdings waren die Effektorfunktionen, in Form von IFNγ- und TNF-Sekretion, unter Glutaminentzug weniger stark in den Gedächtniszellen als in den naiven T-Zellen beeinflusst. Titrationsexperimente zeigten, dass Glutaminkonzentrationen von 0.1 mM die T-Zell-Aktivierung sowie die IFNγ- und TNF-Sekretion inhibierten, eine Konzentration, die schon in Tumoren nachgewiesen wurde. Die Proliferation war bereits bei einer Konzentration von 0.25 mM signifikant reduziert. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass nicht nur Glukose sondern auch Glutamin einen Nährstoff darstellt, um den Tumorzellen und Immunzellen im Tumormikromilieu konkurrieren.
Indem eine Kombination aus verschiedenen Metaboliten supplementiert wurde, die mit dem Glutaminstoffwechsel in Verbindung gebracht werden, wurde versucht ein Ersatzmetabolit für Glutamin zu finden. Das Scheitern dieser Experimente deutet darauf hin, dass Glutamin selbst einen essentiellen Nährstoff für T-Zellen darstellt. Vorläufige Ergebnisse suggerieren, dass die Glutaminabhängigkeit von T-Zellen in der Abwesenheit der Glutamin-Synthetase begründet sein könnte, einem Enzym, das die Reaktion von Glutamat zu Glutamin katalysiert.
In einem nächsten Schritt wurde die Rolle der zellulären Atmung mit Hilfe von Oligomycin analysiert, ein Inhibitor der ATP-Synthase. T-Zell-Funktionen wie die Proliferation oder die IFNγ- und TNF-Sekretion waren stark gehemmt in naiven T-Zellen, aber nur leicht in den zentralen und den Effektor-Gedächtniszellen.
Obwohl die Effektor-Gedächtniszellen als geschwächte Subpopulation gelten, zeigen unsere Ergebnisse, dass diese Zellen weniger stark von einem Nährstoffmangel als naive T-Zellen betroffen sind. Somit sollten auch Effektor-Gedächtniszellen bei immuntherapeutischen Ansätzen, wie dem adoptiven T-Zell-Transfer, berücksichtigt werden.
Da aktivierte T-Zellen einen erhöhten Stoffwechsel aufweisen, ähnlich dem in Tumorzellen, wurde schließlich die Auswirkung von anti-metabolischen Substanzen auf frisch stimulierte CD8 T-Zellen untersucht. Im Hinblick auf einen adoptiven T-Zell-Transfer, wurde zudem der Effekt von klinisch relevanten anti-metabolischen Substanzen auf expandierte T-Zell-Subpopulationen untersucht.
Unter besonderer Berücksichtigung der Bedeutung des Glutamins für die T-Zell-Aktivierung, sollte die Applikation von Inhibitoren, die in den Glutaminstoffwechsel eingreifen, sorgfältig geprüft werden. Infolgedessen wurde in dieser Arbeit der Einfluss von Glutamin-Analoga (DON und Acivicin) sowie Glutaminase-Inhibitoren (BPTES und CB-839) untersucht. Die Inhibition der Glutaminase, die Glutamin zu Glutamat umwandelt, zeigte keinen Effekt auf die T-Zellfunktionen in CD8 T-Zellen, wohingegen die Glutamin-Analoga die T-Zell-Funktionen und die metabolische Aktivität stark supprimierten. Überraschenderweise, zeigte DON keinen Effekt mehr auf expandierte CD8 Subpopulationen.
Da der Glukose-Metabolismus eine übergeordnete Rolle für Tumorzellen spielt, wurde der Einfluss von Substanzen untersucht, die auf die Glykolyse wirken. Die Inhibition der Monocarboxylat-Transporter (MCTs) in Tumorzellen, durch welche die Laktatsekretion blockiert wird, würde Tumorzellen direkt beeinflussen und könnte zusätzlich die anti-tumorale Immunantwort unterstützen, indem eine Laktatakkumulation verhindert wird. Bislang wurden wirksame Inhibitoren lediglich für MCT1 und MCT2 entwickelt. Die beiden nichtsteroidalen Antirheumatika (NSARs, engl. NSAIDs) Diclofenac und Lumiracoxib, beide auch als Cyclooxygenase (COX)-Inhibitoren bekannt, hemmen MCT1 und zugleich MCT4. Da diese die einzigen bekannten Inhibitoren sind, die neben MCT1 auch MCT4 blockieren, könnten diese vielversprechende Substanzen im Kontext zur Tumortherapie darstellen. Obwohl eine Reduktion der glykolytischen Aktivität festgestellt wurde, war die Zytokinproduktion sowohl in naiven als auch in Effektor-Gedächtniszellen sowie in den expandierten Subpopulationen erhalten. Lediglich eine Hemmung der Proliferation war nach sechs Tagen zu beobachten.
Diese Ergebnisse wurden zusätzlich durch eine vollständige Blockade von MCT1 und MCT4 in murinen T-Zellen bestätigt. Um eine pan-Inhibition zu imitieren, wurden MCT4 defiziente T-Zellen in Anwesenheit von einem MCT1/2 Inhibitor kultiviert. Obwohl die glykolytische Aktivität beinahe vollständig inhibiert war, waren die murinen T-Zellen immer noch in der Lage wichtige Effektorzytokine wie IFNγ zu produzieren, wobei die Werte zu einem gewissen Maß reduziert waren.
Die in dieser Arbeit analysierten CD8 T-Zellen wiesen Gruppen-spezifische Unterschiede in ihrer metabolischen Aktivität auf. Während ein Glukoseentzug die T-Zell-Funktionen nicht schädigte, rief ein Glutaminentzug einen starken Effekt auf die T-Zell-Immunantwort hervor. Deshalb stellt der Glukosemetabolismus eine aussichtsreiche Zielstruktur in der Krebstherapie dar, während Medikamente, die auf den Glutaminstoffwechsel wirken, einer sorgfältigen Prüfung bedürfen. Dennoch blieben T-Zellen von den Glutaminase-Inhibitoren unbeeinträchtigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass anti-metabolische Substanzen eine vielversprechende Ergänzung zu immuntherapeutischen Ansätzen darstellen, wie beispielsweise einer Checkpoint Blockade oder einem adaptiven T-Zell-Transfer.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 18:05
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