Currently, most preventive vaccine strategies against the human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) focus on the induction of broadly neutralizing antibodies (bNAbs) targeting the viral envelope glycoprotein (Env). However, all attempts to elicit bNAbs by vaccination remained unsuccessful so far. The development of stabilized Env trimers is considered as first success on the road towards broader ...
Zusammenfassung (Englisch)
Currently, most preventive vaccine strategies against the human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) focus on the induction of broadly neutralizing antibodies (bNAbs) targeting the viral envelope glycoprotein (Env). However, all attempts to elicit bNAbs by vaccination remained unsuccessful so far. The development of stabilized Env trimers is considered as first success on the road towards broader neutralizing antibody responses. Characterized by a favorable antigenicity profile, meaning the efficient presentation of bNAb epitopes and occlusion of non-neutralizing epitopes, these trimers for the first time elicited autologous tier 2 neutralization in animal models. Novel approaches, including particle-based Env delivery and development of improved Env immunogens are considered important steps to broaden humoral immune responses. This thesis investigated methods for the characterization and development of improved Env immunogens. The first project of this thesis investigated the potential of the biophysical in-solution method MicroScale Thermophoresis (MST) for the analysis of soluble and particle-presented Env proteins under artificial (buffer) and physiological conditions (serum). Using two model systems, 1) a five-member Env/V3 chimeric library with distinct binding capacities towards the monoclonal antibody 447-52D, and 2) stabilized BG505 SOSIP.664 trimers and a panel of quaternary structure-characterizing antibodies, it has been demonstrated that MST is useful tool for the analysis of soluble and particle-presented Env immunogens under artificial and near-physiological conditions (50 % serum). Thereby, results were in general agreement with data obtained from enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), validating MST as a fast, low-sample consuming method for the analysis of Env immunogens. The second project focused on the development of a mammalian cell display approach for mapping of bNAb epitopes, providing valuable information for rational vaccine design. For this purpose, a BG505 SOSIP gp160 based alanine substitution library was developed and applied to proof-of-principle screenings with well-characterized bNAbs. Here, the library demonstrated its capacity for epitope mapping. However, further improvements are necessary to turn the library into a powerful mapping tool. The third project aimed to investigate the influence of single glycan deletions on binding of bNAbs. For this purpose, a cellular BG505 SOSIP gp145 glycan-knockout library was generated and applied to fluorescence-activated cell sorting (FACS). An initial screening with the glycan-dependent bNAb PGT135 resulted in a 35-fold enrichment of the Env variant N332A in the applied low-affinity gate. This demonstrates that the library could be a useful to tool to identify glycans that contribute to binding of bNAbs.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Aktuell zielen die meisten präventiven Impfstrategien gegen das humane Immundefizienz-Virus 1 (HIV-1) darauf ab breit-neutralisierende Antikörper (bNAbs) gegen das virale Hüllprotein (Env) zu induzieren. Trotz aller Anstrengungen die diesbezüglich unternommen wurden, blieb die Entwicklung eines Schutz-vermittelnden Vakzins bisher erfolglos. Die Entwicklung von stabilisierten Env Trimeren, welche ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Aktuell zielen die meisten präventiven Impfstrategien gegen das humane Immundefizienz-Virus 1 (HIV-1) darauf ab breit-neutralisierende Antikörper (bNAbs) gegen das virale Hüllprotein (Env) zu induzieren. Trotz aller Anstrengungen die diesbezüglich unternommen wurden, blieb die Entwicklung eines Schutz-vermittelnden Vakzins bisher erfolglos. Die Entwicklung von stabilisierten Env Trimeren, welche sich durch ein vorteilhaftes Immunogenitätsprofil auszeichnen – effektive Präsentation von bNAb Epitopen bei gleichzeitiger Vermeidung der Exposition von nicht-neutralisierenden Antikörper Epitopen – wird als erster Erfolg auf dem Weg zu einem schützenden Vakzin angesehen. In Tierstudien, in denen stabilisierte Env Trimere als Immunogene verabreicht wurden, konnte erstmals eine Neutralisation von autologen tier 2 Viren erreicht werden. Basierend auf diesen Erkenntnissen sollen neue innovative Ansätze, wie beispielsweise eine Partikel-vermittelte Env Präsentation und die Entwicklung von neuartigen Env Immunogenen, dazu beitragen eine breitere humorale Immunantwort zu induzieren. Die Ziele dieser Arbeit waren, zu untersuchen welchen Beitrag biophysikalische und Zytometer-basierte Methoden zur Charakterisierung und Entwicklung von verbesserten Env Immunogenen leisten können. Im ersten Teil der Arbeit sollte untersucht werden, ob sich die biophysikalische Messmethode Microscale Thermophoresis (MST) für die Charakterisierung von Antikörper-Env Interaktionen eignet. Hierbei sollte insbesondere überprüft werden, ob die MST zur Analyse von Partikel-präsentierten Env Proteinen herangezogen werden kann. Zudem sollte die Anwendbarkeit der MST unter physiologischen Bedingungen (Serum) getestet werden. Hierzu wurden zwei Modellsysteme verwendet: 1) Eine Modell-Bibliothek bestehend aus fünf chimären Env Proteinen (Env/V3) mit definiertem Bindungsprofil zum monoklonalen Antikörper 447-52D und 2) stabilisierte BG505 SOSIP.664 Trimere und ein Set von Quartärstruktur-charakterisierenden Antikörpern. Die Ergebnisse zeigten, dass die MST in der Lage ist Interaktionen zwischen löslichen und Partikel-präsentierten Env Proteinen und Antikörpern zu analysieren. Dies gilt sowohl für Messungen unter artifiziellen Bedingungen (Puffer) als auch für Messungen unter nahezu physiologischen Bedingungen (50 % Serum). Die Ergebnisse aus den MST Analysen stimmten dabei im Großen und Ganzen mit Ergebnissen aus enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Experimenten überein, wodurch die MST als schnelle und zugleich sparsame Methode zur Analyse von Env Immunogenen validiert werden konnte. Der zweite Teil der Arbeit konzentrierte sich auf die Entwicklung eines auf Säugetierzellen basierenden Display Verfahrens zu Kartierung von bNAb Epitopen. Zu diesem Zweck wurde eine auf dem BG505 SOSIP gp160 Env basierende Alanin-Substitutionsbibliothek entwickelt, welche mit einem Set von bekannten bNAbs charakterisiert wurde. Hierbei zeigte sich sowohl, dass die Bibliothek prinzipiell für Kartierungsexperimente herangezogen werden kann, als auch, dass noch einige Verbesserungen nötig sind, um aus der Bibliothek in ein robustes und präzises Instrument zur Antikörperkartierung zu generieren. Der dritte Teil der Arbeit zielte darauf ab, den Einfluss einzelner Glykan-Deletionen auf die Bindung von bNAbs zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde eine zelluläre BG505 SOSIP gp145-Glykan-Knockout-Bibliothek generiert. Diese wurde mittels fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) auf ihre Bindung zum glykan-abhängigen bNAb PGT135 hin untersucht. Hierbei konnte eine 35-fache Anreicherung der Env Variante N332A im gate mit niedriger Affinität zum PGT135 Antikörper beobachtet werden. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Bibliothek zukünftig dazu verwendet werden könnte, Glykane zu identifieren die einen Beitrag zur Bindung von bNAbs leisten.
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