| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International (16MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-408315
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.40831
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 23 September 2020 |
| Begutachter (Erstgutachter): | PD Dr. Sabine Amslinger |
| Tag der Prüfung: | 23 September 2019 |
| Institutionen: | Nicht ausgewählt |
| Stichwörter / Keywords: | electrophiles, enones, reactivity, phosphoantigen, protein tagging, covalent protein labeling |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 40831 |
Zusammenfassung (Englisch)
The demanded further representatives of the new compound library of the enone-substituted 1,3,4-oxadiazolines (OXEs) were synthesized. A thia-Michael addition of cysteamine to all compounds bearing the enone unit was proven via LC-MS and UV-Vis spectroscopy, exemplarily also via NMR for OXE1-(4py)’’. Appropriate reactivity assay conditions and the second-order rate constants for all suitable ...
Zusammenfassung (Englisch)
The demanded further representatives of the new compound library of the enone-substituted 1,3,4-oxadiazolines (OXEs) were synthesized. A thia-Michael addition of cysteamine to all compounds bearing the enone unit was proven via LC-MS and UV-Vis spectroscopy, exemplarily also via NMR for OXE1-(4py)’’. Appropriate reactivity assay conditions and the second-order rate constants for all suitable compounds were determined under pseudo-first order conditions. Values between 14.3 and 0.000478 M-1s-1 for k2 values were measured. Thus, the range of values for this compound library covers five orders of magnitude. A detailed analysis under assay conditions shows by-products for some substances and thus limits for the determination of reactivity. OXEp1-(4py)'' was unsuitable for UV-Vis kinetic measurement, therefore the reactivity was measured by LC-MS using OXE4-(4py)’’ for comparison and a k2 value of 0.0032 M-1s-1 was determined for OXEp1-(4py)''.
Anti-inflammatory properties in the form of an inhibition of NO production by NF-κB were found in-vitro in acryl- or crotyl-substituted OXE classes and both OXEp compounds. Moreover, the anti-inflammatory activity of the whole compound library correlates with its electrophilic properties and can be controlled and predicted by their structure. An electrophilicity in the form of 0.330 – 4.27 M-1s-1 together with the crucial structure elements free enone group and pyridinyl unit in the 5‘-position lead reliably to single-digit IC50 values of NO-inhibition. More compounds need to be synthesized and investigated to see if this effect can be pushed further, especially the interesting role of CF3 representatives in the electrophilicity/biological activity ratio needs to be evaluated. This basic work provides a huge variety of structural adjustment features for a further fine-tuning of the desired effects.
A library of small Michael acceptor reactive units was investigated for their reactivity. Reactivity of sulfonic acid derivatives could not be determined due to insufficient absorbance properties of the compound chromophores. For all N-phenylacrylamides, the k2 values were determined and a structure-reactivity relationship was derived.
Spectroscopic properties and reactivity towards cysteamine have been investigated for further electrophiles, juglone derivatives and NO2-flavanone, using LC-MS and UV-Vis spectroscopy. A small anti-inflammatory activity was established for a few compounds. A k2 value determination by the kinetic thiol assay is possible for most substances. For reasons of stability and the occurrence of several reactions, however, the assay conditions for kinetic measurements should be optimized first. The demanded NO2-flavanone was synthesized from simple precursors. Since it is present both isolated and in solution almost quantitatively as flavanone, neither reactivity towards cysteamine nor anti-inflammatory activity could be demonstrated.
In order to further develop the kinetic thiol assay for the testing of colorless enones with fluorescent dyes as probes, first investigations with literature-known fluorescence-active thiols and thiol precursors were carried out, of which MSTI has the best potential. The synthesis and spectroscopic investigation of new aromatic fluorescent thiol dyes could not be completed within this work.
The general labeling ability of the new, photoactivable probe BioBP-HMBPP (103) was proven for all four investigated proteins BSA; papain, BTN3A1 B30.2 wild type and charge transfer mutant at concentrations of 2-60 µM protein. Laser irradiation at 308 nm was successfully used for this purpose and proved to be a very effective tool. When the phosphoantigen binding domain of BTN3A1 30.2 was challenged by adding HMBPP (102) together with BioBP-HMBPP (103), a clear concentration-dependent decay of labeling was observed proving the higher affinity of HMBPP compared to BioBP-HMBPP. This finding is in agreement with the fact that 103 is a Vγ9Vδ2 T cell activator, albeit less active by about 3000 times than natural ligand 102. However, labeling of the B30.2 domain of BTN3A1 was at least partially non-specific as labeling was detected even with 50-fold excess of HMBPP. The labeling of BSA as a random model protein was not impaired in the presence of additional HMBPP. These results demonstrate the specific binding of BioBP-HMBPP to the C5-diphosphate binding unit, which occurs in the BTN3A1 30.2 domain. Probe 103 is a useful tool to discover further unknown proteins involved in Vγ9Vδ2 T cell activation.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Weitere Vertreter der neuen Substanzbibliothek der enonsubstituierten 1,3,4-Oxadiazoline (OXEs) wurden synthetisiert. Ein Thia-Michael-Addukt von Cysteamin an alle Verbindungen, mit Enon-Einheit wurde mittels LC-MS und UV-Vis-Spektroskopie nachgewiesen, exemplarisch auch über NMR für OXE1-(4py)''. Geeignete Reaktivitätstestbedingungen und die Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung für alle ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Weitere Vertreter der neuen Substanzbibliothek der enonsubstituierten 1,3,4-Oxadiazoline (OXEs) wurden synthetisiert. Ein Thia-Michael-Addukt von Cysteamin an alle Verbindungen, mit Enon-Einheit wurde mittels LC-MS und UV-Vis-Spektroskopie nachgewiesen, exemplarisch auch über NMR für OXE1-(4py)''. Geeignete Reaktivitätstestbedingungen und die Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung für alle geeigneten Verbindungen wurden unter Bedingungen pseudo-erster Ordnung bestimmt. Es wurden Werte zwischen 14,3 und 0,000478 M-1s-1 für k2-Werte gemessen. Somit umfasst der Wertebereich für diese Substanzbibliothek fünf Größenordnungen. Eine detaillierte Analyse unter Assaybedingungen zeigt für einige Stoffe Nebenprodukte und damit Grenzen für die Bestimmung der Reaktivität. OXEp1-(4py)'' war für die UV-Vis-Kinetikmessung ungeeignet, daher wurde die Reaktivität von mit LC-MS mit OXE4-(4py)'' als Vergleich gemessen und für OXEp1-(4py)'' ein k2-Wert von 0,0032 M-1s-1 ermittelt.
Entzündungshemmende Eigenschaften in Form einer Hemmung der NO-Produktion durch NF-κB wurden in vitro in acryl- oder crotyl-substituierten OXE-Klassen und auch in OXEp-Verbindungen gefunden. Darüber hinaus korreliert die entzündungshemmende Aktivität der gesamten Substanzbibliothek mit ihren elektrophilen Eigenschaften und kann durch ihre Struktur gesteuert und vorhergesagt werden. Eine Reaktivität in Form von 0,330 - 4,27 M-1s-1s-1 zusammen mit den entscheidenden Strukturelementen freie Enongruppe und Pyridinyleinheit in der 5'-Stellung führen zuverlässig zu einstelligen IC50-Werten der NO-Hemmung. Es müssen mehr Verbindungen synthetisiert und untersucht werden, um zu sehen, ob dieser Effekt selektiv sein kann, insbesondere die interessante Rolle der CF3-Vertreter im Verhältnis Reaktivität/Biologische Aktivität muss bewertet werden. Diese Grundlagenarbeit bietet eine Vielzahl von strukturellen Anpassungsmöglichkeiten für eine weitere Feinabstimmung der gewünschten Effekte.
Eine Bibliothek von kleinen Michael-Akzeptor-Reaktionseinheiten wurde auf ihre Reaktivität hin untersucht. Die Reaktivität von Sulfonsäurederivaten konnte aufgrund unzureichender Absorptionseigenschaften nicht bestimmt werden. Für alle N-Phenylacrylamide wurden die k2-Werte bestimmt und eine Struktur-Reaktivitätsbeziehung abgeleitet.
Spektroskopische Eigenschaften und Reaktivität gegenüber Cysteamin wurden für weitere Elektrophilen, Juglonderivate und NO2-Flavanon mittels LC-MS und UV-Vis-Spektroskopie untersucht. Für einige wenige Verbindungen wurde eine kleine entzündungshemmende Aktivität festgestellt. Eine k2-Wertbestimmung durch den kinetischen Thiol-Assay ist für die meisten Substanzen möglich. Aus Gründen der Stabilität und des Auftretens mehrerer Reaktionen sollten jedoch zunächst die Assaybedingungen für kinetische Messungen optimiert werden. Das geforderte NO2-Flavanon wurde aus einfachen Vorstufen synthetisiert. Da es sowohl isoliert als auch in Lösung fast quantitativ als Flavanon vorliegt, konnte weder Reaktivität gegenüber Cysteamin noch entzündungshemmende Aktivität nachgewiesen werden.
Um den kinetischen Thiol-Assay für die Prüfung von farblosen Enonen mit Fluoreszenzfarbstoffen als Sonden weiterzuentwickeln, wurden erste Untersuchungen mit literaturbekannten fluoreszenzaktiven Thiolen und Thiolvorstufen durchgeführt, von denen MSTI das beste Potenzial hat. Die Synthese und spektroskopische Untersuchung neuer aromatischer fluoreszierender Thiolfarbstoffe konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abgeschlossen werden.
Das allgemeine Labeling der neuen, photoaktivierbaren Sonde BioBP-HMBPP wurde für alle vier untersuchten Proteine BSA; Papain, BTN3A1 B30.2 Wildtyp und Mutante in Konzentrationen von 2-60 µM Protein nachgewiesen. Die Laserbestrahlung bei 308 nm wurde zu diesem Zweck erfolgreich eingesetzt und erwies sich als sehr effektives Werkzeug. Als die Phosphoantigen-Bindungsdomäne von BTN3A1 30.2 durch Zugabe von HMBPP zusammen mit BioBP-HMBPP adressiert wurde, wurde eine konzentrationsabhängige Abnahme des Labelings beobachtet, der die höhere Affinität von HMBPP gegenüber BioBP-HMBPP belegt. Dieser Befund steht im Einklang mit der Tatsache, dass BioBP-HMBPP ein Vγ9Vδ2 T-Zell-Aktivator ist, wenn auch um das etwa 3000fache weniger aktiv als der natürliche Ligand HMBPP. Die Markierung der B30.2-Domäne von BTN3A1 war jedoch zumindest teilweise unspezifisch, da ein Labeling auch bei einem 50-fachen Überschuss an HMBPP festgestellt wurde. Die Markierung von BSA als Modellprotein wurde durch das Vorhandensein von zusätzlichem HMBPP nicht beeinträchtigt. Diese Ergebnisse zeigen die spezifische Bindung von BioBP-HMBPP an die C5-diphosphat-Bindungseinheit, die in der BTN3A1 30.2-Domäne auftritt. Die Sonde ist ein nützliches Werkzeug, um weitere unbekannte Proteine zu entdecken, die an der Aktivierung von Vγ9Vδ2 T-Zellen beteiligt sind.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 17:31
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