| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International PDF - Eingereichte Version Dissertation (6MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-432458
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 27 Mai 2020 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Veronica Egger |
| Tag der Prüfung: | 15 Mai 2020 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Zoologie > Neurophysiologie (Prof. Dr. Veronica Egger) |
| Projekte: | BMBF 710879 |
| Stichwörter / Keywords: | Dendritische Integration, dendritic integration, dendritic spikes, Bulbus olfactorius, Körnerzellen, granule cells, cortical pyramidal cells, Pyramidalzellen, holographic 3D glutamate uncaging, Ca²⁺-imaging, Elektrophysiologie, electrophysiology |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 590 Tiere (Zoologie) |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 43245 |
Zusammenfassung (Englisch)
The inhibitory axonless olfactory bulb granule cells (OB GCs) form reciprocal dendrodendritic synapses with mitral and tufted cells (MCs and TCs) via large spines, mediating recurrent and lateral inhibition. Rat GC dendrites are excitable by local Na⁺ spine spikes and global Ca²⁺- and Na⁺-spikes. Since reaching global threshold potentials also represents the onset of lateral inhibition, the goal ...
Zusammenfassung (Englisch)
The inhibitory axonless olfactory bulb granule cells (OB GCs) form reciprocal dendrodendritic synapses with mitral and tufted cells (MCs and TCs) via large spines, mediating recurrent and lateral inhibition. Rat GC dendrites are excitable by local Na⁺ spine spikes and global Ca²⁺- and Na⁺-spikes.
Since reaching global threshold potentials also represents the onset of lateral inhibition, the goal of my work was to investigate the exact transition from local to global signalling: How many spines, in which position and distribution on the dendritic tree have to be activated to trigger global spikes and what are the molecular key players, i.e. which ion channels are involved.
In the first part of this study we have integrated a holographic projector into the existing commercial two-photon (2P) Galvanometer-based 2D laser scanning microscope with an uncaging unit (Uncaging: Activation of photolabile biologically inactive derivatives of neurotransmitters by photolysis), which allows the simultaneous photostimulation of several spines in three dimensions (3D) in acute brain slices. Patterned 2P photolysis via holographic illumination is a powerful method to investigate neuronal function because of its capability to emulate multiple synaptic inputs in three dimensions (3D) simultaneously. However, like any optical system, holographic projectors have a finite space-bandwidth product that restricts the spatial range of patterned illumination or field-of-view (FOV) for a desired resolution. Such trade-off between holographic FOV and resolution restricts the coverage within a limited domain of the neuron’s dendritic tree to perform highly resolved patterned 2P photolysis on individual spines. Here, we integrate a holographic projector into a commercial 2P galvanometer-based 2D scanning microscope with an uncaging unit and extend the accessible holographic FOV by using the galvanometer scanning mirrors to reposition the holographic FOV arbitrarily across the imaging FOV. The projector system utilizes the microscope’s built-in imaging functions. Stimulation positions can be selected from within an acquired 3D image stack (the volume of interest, VOI) and the holographic projector then generates 3D illumination patterns with multiple uncaging foci. The imaging FOV of our system is 800×800 μm² within which a holographic VOI of 70×70×70 μm³ can be chosen at arbitrary positions and also moved during experiments without moving the sample. We describe the design and alignment protocol as well as the custom software plugin that controls the 3D positioning of stimulation sites. We demonstrate the neurobiological application of the system by simultaneously uncaging glutamate at multiple spines within dendritic domains and consequently observing summation of postsynaptic potentials at the soma, eventually resulting in APs. At the same time, it is possible to perform 2P Ca²⁺ imaging in 2D in the dendrite and thus to monitor synaptic Ca²⁺ entry in selected spines and also local regenerative events such as dendritic APs.
In the second part of this study we applied the system to study dendritic integration in GCs. Less than 10 coactive reciprocal spines were sufficient to generate diverse regional and global signals that also included local dendritic Ca²⁺- and Na⁺-spikes (D-spikes). Individual spines could sense the respective signal transitions as increments in Ca²⁺ entry. Dendritic integration was mostly linear until a few spines below global Na⁺-spike threshold, where often D-spikes set in. NMDARs strongly contributed to active integration, whereas morphological parameters barely mattered. In summary, thresholds for GC-mediated bulbar lateral inhibition are low.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die GABAergen inhibitorischen axonlosen Körnerzellen (GCs) bilden über lange Dornfortsätze (Spines) reziproke dendrodendritische Synapsen mit Mitral- und Büschelzellen (MC/TCs), den wichtigsten Projektionsneuronen des Riechkolbens von Säugern (Bulbus Olfactorius, OB), aus. Diese Synapsen vermitteln die Selbstinhibition von und laterale Inhibition zwischen MC/TCs. Diese dient der ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die GABAergen inhibitorischen axonlosen Körnerzellen (GCs) bilden über lange Dornfortsätze (Spines) reziproke dendrodendritische Synapsen mit Mitral- und Büschelzellen (MC/TCs), den wichtigsten Projektionsneuronen des Riechkolbens von Säugern (Bulbus Olfactorius, OB), aus. Diese Synapsen vermitteln die Selbstinhibition von und laterale Inhibition zwischen MC/TCs. Diese dient der Kontrastverstärkung zwischen ähnlichen Geruchssignalen und der Synchronisation oszillatorischer Aktivität. GCs sind also wesentlich an der Geruchssignalverarbeitung beteiligt. GC-Dendriten sind auf vielfältige Weise hoch erregbar: Synaptische Inputs an einzelnen Spines können Natrium (Na+)-vermittelte Zacken im Membranpotential (Spikes) erzeugen, die auf den Kopf des Spines begrenzt sind und zur reziproken Ausschüttung des Neurotransmitters GABA führen. Eine stärkere Aktivierung führt zu einer globalen Ausbreitung dendritischer Signale, die sowohl niederschwellige Kalzium (Ca2+)-Spikes als auch Na+-Spikes umfassen.
Da das Erreichen der globalen Schwellenpotentiale gleichzeitig das Erreichen der Schwelle zu lateraler Inhibition bedeutet, war das Ziel meiner Arbeit, den genauen Übergang von der lokalen zur globalen Signalgebung zu untersuchen: Wie viele Spines, in welcher Position und Verteilung auf dem dendritischen Baum, müssen aktiviert werden, um globale Spikes auszulösen und was sind die molekularen Hauptakteure, sprich welche Ionenkanäle sind beteiligt.
Um dies optimal zu untersuchen, haben wir im ersten Teil meiner Arbeit einen holographischen Projektor in das bestehende kommerzielle zwei-Photonen (2P) Galvanometer-basierte 2D-Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Uncaging-Einheit (Uncaging: Aktivierung photolabiler biologisch inaktiver Derivate von Neurotransmittern mittels Photolyse) implementiert, der die gleichzeitige Photostimulation mehrerer Spines in drei Dimensionen (3D) in akuten Hirnschnitten ermöglicht.
2P-Uncaging in definierten Mustern mittels holographischer Illumination ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung neuronaler Funktion, da sie in der Lage ist, mehrere synaptische Inputs in verschiedenen Brennebenen gleichzeitig zu emulieren. Wie bei jedem optischen System haben jedoch auch holographische Projektoren ein begrenztes Produkt aus Raum und Bandbreite, was den räumlichen Bereich – oder das Sichtfeld (FOV) – definierter Illumination für eine gewünschte Auflösung einschränkt. Dieser Kompromiss zwischen holographischem FOV und Auflösung schränkt die Reichweite hochauflösender 2P-Uncaging an Spines auf einzelne Teile des dendritischen Baums ein. Wir erweitern das zugängliche FOV, indem wir mit Hilfe der Galvanometer-Scannerspiegel das holographische FOV beliebig über das abbildende FOV positionieren. Das Projektor-System nutzt die im Mikroskop integrierten Bildfunktionen. Die genauen Positionen der Stimulationspunkte können innerhalb eines erfassten 3D-Bildstapels ausgewählt werden (das Volumen von Interesse, VOI). Der holographische Projektor erzeugt dann 3D-Illuminationsmuster mit Hilfe von mehreren Uncaging Fokussen. Das bildgebende FOV unseres Systems ist 800×800 μm2, innerhalb dessen ein holographisches VOI von 70×70×70 μm3 an beliebigen Positionen ausgewählt und auch während des Experiments bewegt werden kann, ohne die Probe selbst zu bewegen. Wir beschreiben detailliert das Design und das Laserausrichtungsprotokoll sowie das individuell angepasste Software-Plugin, das die 3D-Positionierung von Stimulationspunkten steuert. Um die neurobiologische Anwendung grundsätzlich zu demonstrieren, habe ich die Funktion des holographischen Systems zuerst durch Photolyse von „caged“ Glutamat an den Spines entlang der basalen Dendriten kortikaler Pyramidenzellen (PC) in Hirnschnitten junger Ratten getestet. Über Patchpipetten am Zellkörper (Soma) wurden die Zellen mit kalziumempfindlichem Fluoreszenzfarbstoff (OGB-1) gefüllt und elektrische Potentiale aufgezeichnet. Simultanes Uncaging von Glutamat an mehreren Spines führte zur supralinearen Summation postsynaptischer Potentiale am Soma und schließlich zu Aktionspotentialen. Gleichzeitig zeigte ich die Möglichkeit einer 2P-Ca2+-Bildgebung in 2D im Dendriten und ausgewählten Spines, um damit synaptischen Ca2+ Einfluss, sowie lokale regenerative Ereignisse wie lokale dendritische Spikes aufzuzeichnen.
Im zweiten Teil meiner Arbeit wendete ich das System zur Untersuchung dendritischer Integration in GCs an. Wir stellten fest, dass weniger als 10 simultan aktivierte dendrodendritische Spines ausreichen, um lokale und globale dendritische Signale zu erzeugen, die auch lokale Ca2+-Spikes und Na+-Spikes (D-spikes) beinhalten. Obwohl das GC-Ruhepotential im Vergleich zu PCs um ca. -10 mV hyperpolarisiert ist, benötigt das Erreichen des AP-Schwellenpotentials eine ähnliche Anzahl von aktivierten Spines (9,0 ± 1,6 in GCs vs 10 ± 1 in PCs), wobei 5,5 ± 2,1 aktivierte Spines bereits ausreichen, um einen lokalen Ca2+-Spike auszulösen. Die dendritische Integration unterhalb der AP-Schwelle ist meist linear. Bei der Stimulation von 6,5 ± 2,7 Spines zeigten jedoch ∼ 65 % der GCs supralineare Integration, wobei häufig D-spikes auftraten. Einzelne Spines können die Übergänge zwischen den drei Spikes durch schrittweise erhöhten Ca2+-Einfluss erfassen, was vermutlich zur Erhöhung der Freisetzungswahrscheinlichkeit von GABA führt. Außerdem bewirken die einzelnen Spikes eine zunehmend größere Ausbreitung im Dendriten, was zeigt, dass GCs, abhängig vom Input, zu kompartmentalisierter und globaler Signalgebung fähig sind. Durch pharmakologisches Blockieren verschiedener Ionenkanäle zeigten wir, dass NMDA-Rezeptoren stark zur aktiven Integration beitragen. Morphologische Parameter und die Verteilung der aktivierten Spines auf dem Dendriten spielen dagegen kaum eine Rolle.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass Dendriten von GCs zu komplexen Rechenleistungen fähig und Schwellenwerte für die GC-vermittelte laterale Inhibition niedrig sind.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 15:51
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