Especially in higher vertebrates, astrocytes are an indispensible part of signal processing within the brain. Thus, the mode of action of a neuroactive peptide such as OXT cannot be fully understood without this integral part of the CNS. The effects of OXT on neuronal cells have been well characterized, while its effects on astrocytic cells, specifically on OXTR-coupled signaling and its ...
Abstract (English)
Especially in higher vertebrates, astrocytes are an indispensible part of signal processing within the brain. Thus, the mode of action of a neuroactive peptide such as OXT cannot be fully understood without this integral part of the CNS. The effects of OXT on neuronal cells have been well characterized, while its effects on astrocytic cells, specifically on OXTR-coupled signaling and its resulting cellular consequences, are poorly understood and might very well differ. To characterize the effect of OXT on astrocytic gene expression, intracellular signaling, as well as astrocyte-specific proteins, synthetic OXT was either administered icv in male Wistar rats or applied to cultured rat primary cortical astrocytes. Due to the results of this analysis implying an acute OXT-induced cytoskeletal remodeling and alterations to gap-junction coupling, I next examined the underlying molecular mechanisms and cellbiological consequences of these alterations. Here I found that OXT led to rapid elongation and formation of astrocytic processes in vitro and in vivo, while simultaneously impairing astrocytic intercellular connectivity. Mechanistically, both of these effects were OXTR-specific, conveyed via PKC and, to a lesser extent, MEK1/2 signaling. Notably, OXT-induced cytoskeletal remodeling and impairment of gap-junctions were characteristic for OXT, since its closely related sister-peptide AVP did not affect the examined parameters. CLSM and STED-microscopy following icv or ex vivo administration of OXT furthermore revealed changes to astrocyte-neuron spatial relationships in two brain regions associated with high responsiveness of astrocytic markers to OXT, i.e. PVN and hippocampus. In depth in vitro studies identified the previously undescribed Sp1-Gem signaling axis to be at the base of these effects. A combination of knockdown, knockout and overexpression experiments revealed that OXT drives Gem expression via the transcription factor Sp1 and that Gem is required and sufficient for the effects of OXT on astrocytes. The Sp1-Gem axis was differentially regulated by OXT in neuronal cells, identifying it as key driver in the cell type-specific response of astroglial cells to OXT. Based on these findings, astrocyte-specific AAV-mediated Gem or Oxtr shRNA knockdown vectors were established as tools for a targeted manipulation of astrocytic OXTR signaling and future assessment of astrocytic contribution to the physiological and behavioral effects of OXT. To this end, shRNA oligonucleotides were screened for knockdown efficiency in vitro and subsequently packaged into viral vectors providing astrocyte-specific expression via transcriptional control of shRNA expression under the hGFAP promoter.
Translation of the abstract (German)
Besonders in höheren Säugetieren sind Astrozyten ein unverzichtbarer Teil der Signalverarbeitung des Gehirns. Daher kann die Wirkweise eines neuroaktiven Peptids wie Oxytocin (OXT) nicht ohne diesen fundamentalen Teil des zentralen Nervensystems verstanden werden. Die Effekte von OXT auf neuronale Zellen sind gut charakterisiert, während dessen Effekte auf astrozytische Zellen, speziell auf ...
Translation of the abstract (German)
Besonders in höheren Säugetieren sind Astrozyten ein unverzichtbarer Teil der Signalverarbeitung des Gehirns. Daher kann die Wirkweise eines neuroaktiven Peptids wie Oxytocin (OXT) nicht ohne diesen fundamentalen Teil des zentralen Nervensystems verstanden werden. Die Effekte von OXT auf neuronale Zellen sind gut charakterisiert, während dessen Effekte auf astrozytische Zellen, speziell auf OXTR-gekoppelte Signalkaskaden und deren zelluläre Konsequenzen, kaum verstanden sind und sich möglicherweise unterscheiden. Um die Effekte von OXT auf die Genexpression von Astrozyten zu charakterisieren, wurde synthetisches OXT entweder männlichen Wistar Ratten icv verabreicht, oder primären kortikalen Astrozyten zugesetzt. Da die Ergebnisse dieser Analyse eine akute OXT-induzierte Umstrukturierung des Zytoskeletts andeuteten, untersuchte ich als nächstes die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen und zellbiologischen Konsequenzen dieses Effekts. Hier fand ich, dass OXT zu einer schnellen Elongation und Bildung von astrozytischen Fortsätzen in vivo und in vitro führt, während es gleichzeitig die interzellulären Konnektivität verringert. Mechanistisch waren beide dieser Effekte OXTR-spezifisch, sowie PKC und MEK1/2 vermittelt. Weiterhin waren sie charakteristisch für OXT, da das nah verwandte Schwesterpeptid Vasopressin keinen der untersuchten Parameter veränderte. CLSM und STED-Mikroskopieanalysen zeigten zudem Veränderungen an den räumlichen Verhältnissen zwischen Neuronen und Astrozyten in zwei Hirnregionen, die mit besonders hoher Reakivität astrozytischer Marker auf OXT assoziiert waren. Detaillierte in vitro Experimente identifizierten the vorher unbeschriebene Sp1-Gem Signalachse als diesen Effekten zu Grunde liegend. Eine Kombination aus Knockdown- , Knockout- und Überexpressionsexperimenten zeigte, dass OXT die Expression von Gem über den Transkriptionsfaktor Sp1 beeinflusst und dass Gem benötigt und ausreichend für die Effekte von OXT auf Astrozyten ist. Die Sp1-Gem Achse wird in neuronalen Zellen differenziell von OXT reguliert, was ihre Schlüsselrolle in der Zelltyp-spezifischen Reaktion von Astrozyten auf OXT unterstreicht. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden Astrozyten-spezifische AAV-vermittelte Gem oder Oxtr shRNA knockdown Vektoren etabliert. Diese sollen zukünftig eine gezielte Manipulation von astrozytischem OXTR Signaling ermöglichen, sowie helfen, die potenzielle Rolle von Astrozyten in den physiologischen und Verhaltensbiologischen Effekten von OXT zu untersuchen. Hierzu wurden verschiedene shRNA Oligonukleotide auf ihre Knockdowneffizienz in vitro getestet und anschließend in virale Vektoren unter der Kontrolle des hGFAP Promotors verpackt.
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