Background: Metastatic dissemination often occurs at early stages of breast cancer progression implying that disseminated cancer cells (DCCs) evolve outside the primary tumor in a process of selection and adaptation. To identify metastasis founder cells in humans we strived to construct cell lineage trees by longitudinally tracking genetic changes in cancer cells isolated from patients at various disease stages.

Methods: We used sample triplets comprising primary tumor, bone marrow DCCs isolated at presumably curative surgery and CTCs/DCCs at a further time point before and after progressing into metastasis. To prepare samples for single cell lineage tree analysis we developed robust methods for isolation of single cells of high DNA quality from all tissues, including - (i) Isolation of single cells from flash frozen tumor tissue; (ii) Laser capture microdissection to isolate DCCs from diagnostic cytospins; (iii) Isolation of blood CTCs from CellSearch cartridges. In addition, we isolated CD3+ T cells, CD68+ macrophages and oral epithelial cells to serve as outgroups for cell lineage tree analysis. Cell lineage tree reconstructions are based on short tandem repeats (STRs) mutations reflecting cell divisions which determine cellular descent by tracing random mutational events. Around 12000 STR loci are sequenced after target enrichment using a patient-generic panel of duplex molecular inversion probes.

Results: Detection, isolation and whole genome amplification from all sample sources could be successfully established. Results of STR based lineage tree analysis showed a significantly separate clustering of advanced primary tumor cells from metastatic cells. Interestingly these metastatic cells have detectable early DCC ancestors.

Conclusions: The data allows reconstructing the genomic make-up of metastases founder cells from the available phylogenetic trees. Longitudinal analysis of systemic breast cancer evolution may provide insights for diagnostic monitoring and inform the development of novel adjuvant therapies.

Hintergrund: Die Metastasierung tritt häufig in frühen Stadien der Brustkrebsprogression auf, was bedeutet, dass sich die disseminierten Krebszellen (DCCs) in einem Selektions- und Anpassungsprozess außerhalb des Primärtumors entwickeln. Um Metastasen-Gründerzellen beim Menschen zu identifizieren, haben wir versucht, Zellstammbäume zu konstruieren, indem wir genetische Veränderungen in Krebszellen, die von Patientinnen in verschiedenen Krankheitsstadien isoliert wurden, über längere Zeit verfolgt haben.
Methoden: Wir verwendeten Proben aus Primärtumor, Knochenmark-DCCs, die bei vermutlich kurativer Operation isoliert wurden, und CTCs/DCCs zu einem weiteren Zeitpunkt vor und nach Fortschreiten der Metastasierung. Zur Vorbereitung der Proben für die Einzelzellstammbaumanalyse entwickelten wir robuste Methoden zur Isolierung von Einzelzellen mit hoher DNA-Qualität aus allen Geweben, einschließlich - (i) Isolierung von Einzelzellen aus blitzgefrorenem Tumorgewebe; (ii) Laser-Capture-Mikrodissektion zur Isolierung von DCCs aus diagnostischen Zytospins; (iii) Isolierung von Blut-CTCs aus CellSearch-Kartuschen. Darüber hinaus isolierten wir CD3+ T-Zellen, CD68+ Makrophagen und orale Epithelzellen, die als Kontrollgruppen für die Analyse des Zellstammbaums dienten. Zellstammbaum-Rekonstruktionen basieren auf kurzen Tandem-Repeat-Mutationen (STRs), die Zellteilungen widerspiegeln, welche die zelluläre Abstammung bestimmen, indem sie zufällige Mutationsereignisse verfolgen. Etwa 12000 STR-Loci werden nach der Zielanreicherung unter Verwendung eines patientengenerischen Panels von molekularen Duplex-Inversionssonden sequenziert.
Ergebnisse: Nachweis, Isolierung und Amplifikation des gesamten Genoms aus allen Probenquellen konnten erfolgreich etabliert werden. Die Ergebnisse der STR-basierten Abstammungsbaum-Analyse zeigten ein signifikant separates Clustering von fortgeschrittenen Primärtumorzellen und metastasierten Zellen. Interessanterweise haben diese metastatischen Zellen nachweisbare frühe DCC-Vorfahren.
Schlussfolgerungen: Die Daten ermöglichen die Rekonstruktion des genomischen Aufbaus von Metastasen-Gründerzellen aus den verfügbaren Stammbäumen. Die Langzeitverfolgung der systemischen Brustkrebsentwicklung könnte Erkenntnisse für die diagnostische Überwachung liefern und die Entwicklung neuer adjuvanter Therapien unterstützen.