| License: Creative Commons Attribution 4.0 (4MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-445976
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.44597
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 16 December 2021 |
| Referee: | PD Dr. Stefanie Sprunck |
| Date of exam: | 16 December 2020 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Pflanzenwissenschaften > Lehrstuhl für Zellbiologie und Pflanzenphysiologie (Prof. Dr. Klaus Grasser) |
| Keywords: | gamete interactions, sperm cell, DMP9 |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 44597 |
Abstract (English)
Flowering plants have evolved a unique mode of sexual reproduction termed double fertilization, where two female gametes, the egg cell and the central cell, get fertilized by one sperm cell each. The fertilized egg cell gives rise to the zygote, whereas fertilization of the central cell results in formation of the nutrient-storing and embryo-nourishing endosperm. Successful seed formation ...
Abstract (English)
Flowering plants have evolved a unique mode of sexual reproduction termed double fertilization, where two female gametes, the egg cell and the central cell, get fertilized by one sperm cell each. The fertilized egg cell gives rise to the zygote, whereas fertilization of the central cell results in formation of the nutrient-storing and embryo-nourishing endosperm. Successful seed formation requires both fertilization events, but molecular mechanisms regulating gamete recognition, attachment and fusion are poorly understood. Prior to this work, only three proteins residing or acting on plant gamete surfaces were known: The sperm membrane protein GAMETE EXPRESSED2 (GEX2) is involved in pre-fusion attachment whereas HAPLESS2 (HAP2) functions as membrane fusogen. Cysteine-rich EGG CELL1 (EC1) peptides are secreted by the egg cell and act as sperm activating molecules by inducing HAP2 re-localization from endomembrane compartments to the sperm surface.
In order to identify novel sperm cell surface proteins with a role in gamete interactions, a protocol for bulk sperm cell isolation from maize was established in this work. Sperm cells were used for RNA-seq transcriptomic profiling and proteomics approaches. The protein composition of membrane-enriched sperm microsomal fractions was analyzed by high-throughput LC-MS/MS. Combined with publicly available Arabidopsis sperm transcriptome data, the maize sperm cell proteome and transcriptome data were used to select candidate genes, or gene families, for functional studies in Arabidopsis. Translational reporter activity in sperm cells was detected for 5 candidates. Assuming functional redundancies, CRISPR/Cas9 was established and genome edited mutants were screened for fertilization defects.
Loss-of-function mutants of two sperm-expressed DOMAIN OF UNKNOWN FUNCTION 679 Membrane Proteins (DMP8 and DMP9) displayed severe reproductive defects. dmp8,9 double mutants showed impaired male fertility and up to four unfused dmp8,9 sperm cells were frequently observed close to the female gametes. Beside fertilization failure, also aborted seeds were observed in dmp8,9 siliques, caused by single fertilization events. Quantification revealed that dmp8,9 sperm cells preferentially fertilize the central cell. To address whether gamete adhesion or fusion is impaired in sperm cells lacking functional DMP8 and DMP9, in situ cell adhesion assays were performed and showed that dmp8,9 sperm cells frequently manage to attach to the egg cell, suggesting DMP8 and DMP9 act after gamete attachment but before or during fusion.
DMPs are short four-span transmembrane proteins conserved in Viridiplantae (green plants). To gain insight about functionally important DMP9 regions and evolutionary conserved protein function, complementation of the dmp8,9 mutant was performed.
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Deletion constructs expressing truncated DMP9 versions failed to rescue the mutant phenotype. Complementation with most ancient DMP from Chlamydomonas reinhardtii (CrDMP) was not successful, however a putative DMP9 ortholog from Amborella trichopoda (AmTrDMP) managed to partially rescue the fusion-defective dmp8,9 phenotype, suggesting functional conservation at least in flowering plants.
The biochemical function of DMPs is not yet known, but Arabidopsis thaliana DMP1 was suggested to be involved in membrane remodeling. Transient overexpression of DMP9-GFP in tobacco leaf epidermis cells induced DMP1-like membrane remodeling events, which are likely artificial.
Mutant dmp8,9 sperm cells were furthermore used as a tool to investigate sperm-induced events in the egg cell. Upon sperm cell arrival, the Arabidopsis egg cell secretes EC1 proteins to render the sperm cells competent for fusion but the precise moment of triggered EC1 secretion is not yet known. Quantification of EC1-GFP signals in unfertilized egg cells and in those with adjacent, unfused dmp8,9 sperm cells gave evidence that the secretion of EC1-GFP by the egg cell does not depend on DMP8/9 and is upstream of sperm adhesion. Furthermore, in mammals two plasma membrane-localized TETRASPANINS (TETs) are crucial for gamete interactions and accumulate at the egg-sperm contact site to form fusion competent membrane patches. To investigate whether a similar scenario holds true during flowering plant gamete interactions, the subcellular distribution of egg- and central cell-expressed Arabidopsis thaliana TET9-GFP was monitored during interaction with dmp8,9 sperm cells. A role for TET9 in the formation of fusion-competent sites seems unlikely, as TET9-GFP remained uniformly distributed at the egg- and central cell plasma membrane with attached but unfused dmp8,9 sperm cells. This suggests that TETs expressed in angiosperm gametes might fulfil different, yet unknown functions.
In summary, two sperm-expressed membrane proteins were discovered that function after gamete attachment to facilitate gamete fusion. It will be an important task for the future to unravel the biochemical-mechanistic function of DMP8 and DMP9, which may involve membrane remodeling, supporting the activity of the fusogen HAP2, or the activation or delivery of HAP2 to the sperm cell surface. The maize sperm transcriptomic and proteomic datasets that have been generated in this work will serve as valuable resources for the identification of more membrane-localized proteins with a role during gamete interaction and fusion.
Translation of the abstract (German)
Blütepflanzen haben einen einzigartigen Befruchtungsmechanismus evolviert, der sich doppelte Befruchtung nennt. Hierbei werden zwei weibliche Gameten (Ei- und Zentralzelle) durch zwei Spermazellen befruchtet. Aus der befruchteten Eizelle entsteht der Embryo, während die befruchtete Zentralzelle ein Nährgewebe (Endosperm) bildet. Samenbildung erfordert beide dieser Befruchtungsereignisse, ...
Translation of the abstract (German)
Blütepflanzen haben einen einzigartigen Befruchtungsmechanismus evolviert, der sich doppelte Befruchtung nennt. Hierbei werden zwei weibliche Gameten (Ei- und Zentralzelle) durch zwei Spermazellen befruchtet. Aus der befruchteten Eizelle entsteht der Embryo, während die befruchtete Zentralzelle ein Nährgewebe (Endosperm) bildet. Samenbildung erfordert beide dieser Befruchtungsereignisse, allerdings sind die molekularen Mechanismen die zu Gametenerkennung -Adhäsion und -Fusion führen schlecht verstanden. Zu Beginn dieser Arbeit waren nur 3 Proteine welche an direkter Gameteninteraktion beteiligt sind bekannt: GEX2 ist an der Anheftung beteiligt während HAP2 als Fusogen wirkt. Die Eizelle sekretiert kleine Cystein-reiche EC1 Peptide, welche Spermazellen aktivieren indem sie die Relokalisation von HAP2 aus Endomembran-Kompartimenten an die Spermazell-Oberfläche induzieren.
Um neue Spermazell-Membranproteine welche an Gameteninteraktion beteiligt sind zu identifizieren wurde ein Isolationsprotokoll für Spermazellen aus Maispollen etabliert und das Transkriptom und Proteom charakterisiert. Kombiniert mit öffentlich zugänglichen Daten wurden diese Datensätze zur Kandidatenselektion für funktionelle Studien in Arabidopsis herangezogen. Für 5 Kandidaten wurde Reporteraktivität in Spermazellen beobachtet. Für diese wurde Genomeditierung mittels CRISPR/Cas9 etabliert und Mutanten wurden auf Befruchtungsdefekte untersucht.
Mutanten für 2 Spermazell-exprimierte DOMAIN OF UNKNOWN FUNCTION 679 Membranproteine (DMP8 und DMP9) zeigten stark eingeschränkte Fertilität. Bis zu 4 unfusionierte dmp8,dmp9 Spermazellen wurden in den Samenanlagen beobachtet. Weiterhin wurden degenerierte Samen beobachtet welche auf Einzelbefruchtung zurück zu führen sind, wobei dmp8,dmp9 Spermazellen bevorzugt die Zentralzelle befruchten. Weiterhin haben in situ Adhäsionsassays gezeigt dass dmp8,dmp9 Spermazellen erfolgreich an die Eizelle adhärieren, was darauf hinweist dass DMP8 und DMP9 ihre Funktion nach der Adhäsion, jedoch vor der Membranfusion ausüben.
DMPs sind kleine Proteine mit 4 Transmembrandomänen welche in grünen Pflanzen (Viridiplantae) konserviert sind. Um funktionelle Proteindomänen und evolutionäre Verhältnisse aufzuklären, wurde die dmp8,dmp9 Mutante komplementiert. Komplementation mit dem alten DMP aus der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii war nicht erfolgreich, während das putative DMP9 Ortholog aus der urtümlichen Blütepflanze Amborella trichopoda den Phänotyp partiell komplementiert hat. Dies weist auf funktionelle Konservierung in Blütepflanzen hin.
Die biochemische Funktion von DMPs ist nicht bekannt. Hinweise auf eine Rolle von DMP1 bei Membran-Remodellierung. Überexpression von DMP9-GFP in Tabakblättern führte ebenfalls zu Membran-Remodellierung, wobei es sich jedoch wahrscheinlich um Artefakte handelt.
Weiterhin wurden dmp Mutanten genutzt, um Spermazell-induzierte Ereignisse in der Eizelle zu untersuchen. Die Eizelle sekretiert EC1 Peptide, der präzise Moment dafür ist jedoch nicht bekannt. Quanzifizierung von EC1-GFP Sekretion in Samenanlagen mit unfusionierten dmp8,dmp9 Spermazellen zeigten dass EC1-GFP erfolgreich sekretiert wurde. In Säugetieren spielen TETRASPANINE (TETs) der Eizelle eine wichtige Rolle bei der Gameteninteraktion, und akkumulieren an der Interaktionsstelle mit der Spermazelle. TET9-GFP wird in der Arabidopsis thaliana Eizelle exprimiert, akkumulierte jedoch nicht an der Kontaktstelle mit unfusionierten dmp8,9 Spermazellen.
Zusammenfassend wurden zwei neue Spermazell-Membranproteine mit einer Rolle an direkter Gameteninteraktion entdeckt, welche nach der Adhäsion wirken um Gametenfusion zu regulieren. Die biochemisch-mechanistische Wirkweise dieser Proteine bedarf jedoch weiterer Aufklärung.
Metadata last modified: 16 Dec 2021 07:34
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