| License: Creative Commons Attribution 4.0 Synthesis and pharmacological characterization of dibenzodiazepinone-type muscarinic M2-receptor antagonists conjugated to fluorescent dyes or small peptides. (32MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-448399
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 18 February 2021 |
| Referee: | PD Dr. Max Keller and Prof. Dr. Pierre Koch |
| Date of exam: | 29 January 2020 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | Muscarinic Receptors, Dualsteric Ligands, Fluorescently-labeled Ligands, M2R-selectivity |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 44839 |
Abstract (English)
In humans, the family of muscarinic acetylcholine receptors (mAChR, MRs) comprises five subtypes (M1R-M5R), belonging to class A of the GPCR superfamily. MRs mediate the action of the neurotransmitter acetylcholine (ACh) in the central and peripheral nervous system. Whereas the M1R, M3R and M5R preferably couple to Gq-type G-proteins, the M2 and M4 receptor mainly activate Gi/o-type G-proteins. ...
Abstract (English)
In humans, the family of muscarinic acetylcholine receptors (mAChR, MRs) comprises five subtypes (M1R-M5R), belonging to class A of the GPCR superfamily. MRs mediate the action of the neurotransmitter acetylcholine (ACh) in the central and peripheral nervous system. Whereas the M1R, M3R and M5R preferably couple to Gq-type G-proteins, the M2 and M4 receptor mainly activate Gi/o-type G-proteins. Due to the high conservation of the orthosteric (acetylcholine) binding site within the family of MRs, the development of highly subtype selective MR ligands is difficult. Selective MR ligands are needed as molecular or pharmacological tools and also as new drug candidates anticipated to cause less adverse effects. As the vestibule of MRs, also referred to as the common allosteric site, is less conserved than the orthosteric pocket, the dualsteric ligand approach, i.e. the design of
ligands, which simultaneously address the orthosteric and an allosteric binding site, was suggested as a promising strategy to develop MR ligands with high affinity and improved subtype selectivity.
This work was aiming at the synthesis and pharmacological characterization of dibenzodiazepinone-type MR ligands with pronounced M2R selectivity. The tricyclic MR ligands were prepared by linking the pharmacophore DIBA via various linker moieties to several short peptides, yielding a series of DIBA-peptide conjugates (70 compounds). The linker structure was varied with respect to length, rigidity/flexibility and number of basic groups. All peptide moieties contained at least one basic amino acid. In addition to proteinogenic amino acids, also unnatural amino acids were incorporated. MR affinities and selectivity profiles of the DIBA-peptide conjugates were determined by radioligand competition binding at CHO-hMxR cells (x = 1-5) using [3H]N-methyl scopolamine as labeled ligand. M1, M2 and M4 receptor affinities were determined for all target compounds. Additionally, M3 and M5 receptor affinities were determined for selected compounds, showing either high M2R selectivity over the M1 and M4 receptor, or a very low or no preference for the M2R.
The study revealed that, besides the peptide structure, the type of the linker considerably determines M2R affinity and selectivity. DIBA-peptide conjugates derived from amine precursor 35 (compounds 101-106), containing an N-acylated 4-aminopiperidine and a bisalkylated piperazine ring in the linker moiety, exhibited pronounced M2R selectivity (e.g. 105: Ki M1R/M2R/M3R/M4R/M5R = >140:1:>160:59:>140), but only moderate M2R affinity (pKi 7.05-7.67). The subset of compounds derived from amine precursor 40 (107-109), representing the higher homologue of precursor 35 (extension of the linker by one methylene group), exhibited higher M2R affinities (pKi 8.93-9.08) and displayed also high M2R selectivity (e.g. 109: Ki M1R/M2R/M3R/M4R/M5R = 70:1:11,000:48:6000). Considering M2R over M3 and M5 receptor selectivity, compounds such as DIBA-peptide conjugates 107- 109 represent the most selective M2R antagonists reported to date. Regarding M2R over M1 and M4 receptor selectivity, higher M2R selectivity compared to 103-105 or 107-109 had only been reported for one other compound class. For three selected DIBA-peptide conjugates, M2R antagonism was confirmed in a M2R miniGi recruitment assay yielding Kb
values, which were in excellent agreement with the respective Ki values from radioligand competition binding studies.
The investigation of three selected DIBA-peptide conjugates (3, 4, 146) with respect to stability in human plasma showed highly stability against proteolytic degradation (> 99% intact compound after 24 h at 37 °C).
Moreover, six fluorescently labeled dibenzodiazepinone-type MR ligands (164-169) were prepared using various fluorescent dyes (5-TAMRA, BODIPY, pyridinium dye Py-1, and pyridinium dye Py-5). All fluorescent probes exhibited high M2R affinity (pKi (radioligand competition binding): 8.75‐9.62), a low preference for the M2R over the M1 and M4 receptor and moderate to pronounced M2R selectivity compared to the M3R and M5R. The
fluorescent ligands were successfully used as probes in flow cytometric M2R saturation binding assays resulting in pKd values of 8.36-9.19. Therefore, they are considered useful molecular tools for future studies using methods such as fluorescence anisotropy and BRET based MR binding assays.
In conclusion, this thesis afforded new fluorescently labeled molecular tools for the M2R and new highly selective M2R antagonists, which might serve as lead structures for the development of drug-like selective M2R antagonists, representing potential therapeutics for the treatment of diseases associated with cholinergic dysfunction such as Alzheimer’s disease.
Translation of the abstract (German)
Beim Menschen umfasst die Familie der muskarinischen Acetylcholinrezeptoren (mAChR, MRs) fünf Subtypen (M1R-M5R), die zur Klasse A der GPCR-Superfamilie gehören. MRs vermitteln die die Wirkung des Neurotransmitters Acetylcholin (ACh) im zentralen und peripheren Nervensystem. Während der M1R, M3R und M5R bevorzugt an Gq-Typ G-Proteine koppeln, aktivieren der M2 und M4-Rezeptor hauptsächlich ...
Translation of the abstract (German)
Beim Menschen umfasst die Familie der muskarinischen Acetylcholinrezeptoren (mAChR, MRs) fünf Subtypen (M1R-M5R), die zur Klasse A der GPCR-Superfamilie gehören. MRs vermitteln die die Wirkung des Neurotransmitters Acetylcholin (ACh) im zentralen und peripheren Nervensystem. Während der M1R, M3R und M5R bevorzugt an Gq-Typ G-Proteine koppeln, aktivieren der M2 und M4-Rezeptor hauptsächlich G-Proteine vom Gi/o-Typ. Aufgrund der hohen Konservierung der orthosterischen (Acetylcholin-)Bindungsstelle innerhalb der MR-Familie ist die Entwicklung von hoch Subtyp-selektiven MR-Liganden schwierig. Selektive MR-Liganden werden als molekulare oder pharmakologische Werkzeuge und auch als neue Wirkstoffkandidaten gebraucht, von denen man erwartet, dass sie weniger unerwünschte Nebenwirkungen haben. Da die „vestibule“ der MRs, die auch als allosterische Stelle bezeichnet wird, weniger konserviert ist als die orthosterische Bindungstasche, wurde der dualsterische Ligandenansatz, d.h. das Design von Liganden, die gleichzeitig die orthosterische und eine allosterische Bindungsstelle adressieren, als eine vielversprechende Strategie zur Entwicklung von MR-Liganden mit hoher Affinität und verbesserter Subtyp-Selektivität, angesehen.
Diese Arbeit hatte die Synthese und pharmakologische Charakterisierung von MR-Liganden vom Dibenzodiazepinon-Typ mit ausgeprägter M2R-Selektivität als Zielsetzung. Die trizyklischen MR-Liganden wurden hergestellt, indem das Pharmakophor DIBA über verschiedene Linker an kurzen Peptiden verbunden wurde, was eine Reihe von DIBA-Peptid-Konjugaten (70 Verbindungen) ergab. Die Linkerstruktur wurde hinsichtlich Länge, Rigidität/Flexibilität und Anzahl der basischen Gruppen variiert. Alle Peptideinheiten enthielten mindestens eine basische Aminosäure. Zusätzlich zu proteinogenen Aminosäuren wurden auch unnatürliche Aminosäuren eingebaut. MR-Affinitäten und Selektivitätsprofile der DIBA-Peptid-Konjugate wurden durch Radioliganden-Kompetitions-Bindungsassays an CHO-hMxR-Zellen (x = 1-5) unter Verwendung von [3H]N-Methylscopolamin als markierterLigand bestimmt. Für alle Zielsubstanzen wurden die M1-, M2und M4-Rezeptoraffinitäten bestimmt. Zusätzlich wurden die M3- und M5-Rezeptoraffinitäten für ausgewählte Verbindungen bestimmt, die entweder eine hohe M2R-Selektivität gegenüber dem M1- und M4-Rezeptor oder eine sehr geringe oder keine Präferenz für den M2R zeigten.
Die Studie zeigte, dass neben der Peptidstruktur auch der Typ des Linkers die M2R-Affinität und Selektivität maßgeblich bestimmt. DIBA-Peptid-Konjugate, abgeleitet vom Amin Vorläufer 35 (Verbindungen 101-106), die ein N-acyliertes 4-Aminopiperidin und einen N-acyliertes 4-Aminopiperidin und einen bisalkylierten Piperazinring im Linker-Rest enthalten, zeigten eine ausgeprägte M2R-Selektivität (z. B. 105: Ki M1R/M2R/M3R/M4R/M5R = >140:1:>160:59:>140), aber nur moderate M2R-Affinität (pKi 7,05-7,67). Die Untergruppe der Verbindungen, die sich von der Aminvorstufe 40 (107-109) ableiten, die das höhere Homologe des Vorläufers 35 darstellen (Verlängerung des Linkers um eine Methylengruppe), wiesen höhere M2R-Affinitäten auf (pKi 8,93-9,08) und zeigten auch eine hohe M2R-Selektivität (z.B. 109: Ki M1R/M2R/M3R/M4R/M5R = 70:1:11.000:48:6000). Hinsichtlich der M2R-Selektivität gegenüber M3- und M5-Rezeptors, stellen Verbindungen wie die DIBA-Peptidkonjugate 107-109 die selektivsten M2R-Antagonisten dar, über die bisher berichtet wurde.
Bezüglich der M2R-Selektivität gegenüber M1- und M4-Rezeptor war eine höhere M2R-Selektivität im Vergleich zu 103-105 oder 107-109 nur für eine andere Verbindungsklasse berichtet worden. Für drei ausgewählte DIBA-Peptid Konjugate wurde der M2R-Antagonismus in einem M2R-Mini-Gi-Rekrutierungsassay bestätigt, der Kb Werte lieferte, die in ausgezeichnet mit den jeweiligen Ki-Werten aus Radioliganden-Kompetitionsbindungsstudien übereinstimmten.
Die Untersuchung von drei ausgewählten DIBA-Peptid-Konjugaten (3, 4, 146) hinsichtlich Stabilität in humanem Plasma zeigte eine hohe Stabilität gegen proteolytischen Abbau (> 99% intakte Verbindung nach 24 h bei 37 °C).
Außerdem wurden sechs fluoreszenzmarkierte MR-Liganden vom Dibenzodiazepinon-Typ (164-169) unter Verwendung verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe (5-TAMRA, BODIPY, Pyridinium-Farbstoff Py-1, und Pyridinium-Farbstoff Py-5) hergestellt. Alle Fluoreszenzliganden zeigten eine hohe M2R-Affinität (pKi (Radioligandkompetitionsassay): 8,75-9,62), eine geringe Präferenz für den M2R gegenüber dem M1- und M4-Rezeptor und eine moderate bis ausgeprägte M2R-Selektivität im Vergleich zum M3R und M5R. Die Fluoreszenzliganden wurden erfolgreich als Proben in durchflusszytometrischen M2R-Sättigungsbindungsassays eingesetzt, die zu pKd-Werten von 8,36-9,19 führten. Daher werden sie als nützliche molekulare Werkzeuge für zukünftige Studien mit Methoden wie Fluoreszenz-Anisotropie und BRET basierten MR-Bindungsassays angesehen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit neue fluoreszenzmarkierte molekulare Werkzeuge für den M2R und neue hochselektive M2R-Antagonisten, die als Leitstrukturen für die Entwicklung selektiver M2R-Antagonisten dienen könnten, die potenzielle Therapeutika für die für die Behandlung von Krankheiten, die mit cholinerger Dysfunktion einhergehen, wie z.B. Alzheimer Krankheit, hervorgebracht hat.
Metadata last modified: 18 Feb 2021 09:34
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