| License: Publishing license for publications excluding print on demand (8MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-459694
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.45969
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Number of Pages: | 166 |
| Date: | 10 June 2021 |
| Referee: | Prof. Dr. Herbert Jägle and Prof. Dr. Martin Fleck and Prof. Dr. Katja Hanack |
| Date of exam: | 30 April 2021 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Augenheilkunde |
| Keywords: | FHR-1, FHR-3, complement system, AMD, complement therapeutics, Komplementsystem, Komplement-Therapeutika |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | No |
| Item ID: | 45969 |
Abstract (German)
Das humane Komplementsystem ist ein essentieller Teil der angeborenen Immunität, das aus einem präzise regulierten Zusammenspiel von über 40 löslichen und Membran-gebundenen Proteinen besteht. Der wichtigste Negativregulator des Komplementsystems ist Faktor H (FH). Seit über zehn Jahren ist ein Polymorphismus in den CFH-verwandtenGenen CFHR3 und CFHR1 beschrieben, der eine Deletion dieser Gene ...
Abstract (German)
Das humane Komplementsystem ist ein essentieller Teil der angeborenen Immunität, das aus einem präzise regulierten Zusammenspiel von über 40 löslichen und Membran-gebundenen Proteinen besteht. Der wichtigste Negativregulator des Komplementsystems ist Faktor H (FH). Seit über zehn Jahren ist ein Polymorphismus in den CFH-verwandtenGenen CFHR3 und CFHR1 beschrieben, der eine Deletion dieser Gene (ΔCFHR3/1) veranlasst und mit einem protektiven Effekt auf die Entstehung der altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) assoziiert wird. Bei der AMD handelt es sich um eine multifaktorielle senile Netzhauterkrankung, die zu einer hochgradigen Sehbehinderung bis hin zur Erblindung führen kann. Die Pathomechanismen der AMD, und inwiefern die Komplementproteine FHR-3 und FHR-1 in die Entstehung und den Verlauf der Erkrankung involviert sind, sind bisher nicht eindeutig geklärt. Ziel dieser Doktorarbeit war es daher, die Funktion von FHR-3 und FHR-1, mit Hilfe von spezifischen monoklonalen Antikörpern (mAk), zu bestimmen und zu modulieren. Dabei sollte die Wirkung der Antikörper sowohl auf das systemische als auch auf das intraokulare Komplementsystem untersucht werden. Die Funktionsaufklärung von FHR-3 und FHR-1, in Bezug auf die AMD-Pathogenese, sollte damit bedeutend vorangetrieben werden und im besten Fall ein putativer lokaler Antikörper-basierter Therapieansatz für die Bekämpfung retinaler Degenerationserkrankungen geliefert werden. Zunächst wurden die in der Masterarbeit generierten monoklonalen Antikörper, die ein Peptid in der fünften C-terminalen Domäne (SCR 5) von FHR-3 targetieren, eingehend charakterisiert. Dabei konnte ein Antikörper, RETC-2, als hochspezifisch für humanes FHR-3 ausgewählt werden. RETC-2 detektierte sowohl eigens hergestelltes, rekombinantes FHR-3 als auch natives FHR-3 aus humanem Serum. Mit Hilfe von RETC-2 konnte FHR-3 in Seren verschiedener Autoimmunerkrankungen quantifiziert werden, und eine signifikante Steigerung dieses Proteins in rheumatischen Autoimmunerkrankungen festgestellt werden. Ein systemischer Einfluss von FHR-3 auf die AMD wurde nicht beobachtet. RETC-2 färbte jedoch lokal exprimiertes FHR-3 in Makrophagen/Mikroglia Zellen einer 92-jährigen degenerierten humanen Retina. Da es in der alternden und entzündeten Retina zur Ablagerung von Komplementproteinen und Peroxidationsprodukten kommt, wurde der lokale Effekt von FHR-3 und die blockierende Wirkung von RETC-2 analysiert. FHR-3 konkurrierte mit dem Komplement-Negativregulator FH um die Bindung sowohl an C3b, als auch an oxidative Stressepitope CEP (ω-carboxyethyl)pyrrole), MDA (Malondialdehyd) und MAA (Malondialdehyd-Acetaldehyd). FHR-3 wirkt damit als indirekter Aktivator des Komplementsystems, indem es die FH-Funktion negativ beeinflusst. RETC-2 blockierte diese Interaktion und führte zu einer verbesserten FH-Homöostase in vitro. Im nächsten Projekt dieser Arbeit wurden monoklonale Antikörper gegen humanes FHR-1 hergestellt. Es konnten fünf Klone isoliert werden, die spezifisch ein immunogenes Peptid in der SCR 3 Domäne von FHR-1 targetierten. Davon detektierte ein Klon, 472, sowohl eigens hergestelltes rekombinantes FHR-1 als auch natives FHR-1 aus humanem Serum. MAk 472 kreuz-reagierte jedoch mit rekombinantem FHR-3 im ELISA. Eine Immunpräzipitation des anti-FHR-1 Antikörpers 472 aus humanem Serum und anschließender Massenspektrometrie-Analyse bestätigte die spezifische Interaktion von FHR-1 mit dem mAk 472. Da die vielversprechenden Ergebnisse des anti-FHR-3 Antikörpers RETC-2 auf eine lokale Wirkung von FHR-3 im humanen Auge hindeuteten, konzentrierten sich die nachfolgenden Versuche hauptsächlich auf diesen Antikörper und den intraokularen Effekt seines spezifischen Antigens. Aufgrund der immunreaktiven und komplement-aktivierenden Eigenschaften des murinen IgG2b Fc-Teils von RETC-2, erfolgte die Chimärisierung des FHR-3-bindenden Antikörpers. Hierbei wurden zunächst die variablen Antikörperregionen von RETC-2 amplifiziert und in kommerzielle Vektorkonstrukte, die nicht komplement-aktivierende humane IgG4 konstante Antikörperregionen exprimieren, kloniert. Anschließend wurde der chimärisierte Antikörper RETC-2-ximab über Co-Transfektion in HEK293T-Zellen exprimiert und mittels Protein G Affinitätschromatografie aufgereinigt. Eine spezifische Bindung von RETC-2-ximab an FHR-3 wurde über ELISA und Western Blot erfolgreich getestet. Ein umfangreiches Projekt dieser Arbeit befasste sich mit dem putativen Effekt von FHR-3 auf humane RPE Zellen. RPE Zellen exprimieren kein CFHR3. Zunächst wurde die Kultivierung der RPE-Zelllinie ARPE-19 optimiert. Es zeigte sich, dass sich alternde ARPE-19 Zellen der Passage 38 (P38) im Vergleich zu jungen ARPE-19 Zellen (P25) in epithelial-mesenchymaler Transition (EMT) befanden. Sie exprimierten einerseits tight junctions schwächer und keine kompakten apikalen F-Aktin Ringe. Zum anderen waren mesenchymale Marker-Gene Vimentin, α-Aktin und Kollagen Typ 1 signifikant hochreguliert in alternden ARPE-19 Zellen. Sowohl alternde als auch junge ARPE-19 wurden apikal mit rekombinatem FHR-3, unter Serum-freien Bedingungen, inkubiert. Dabei wurde festgestellt, dass FHR-3 von alternden ARPE-19 (P38) aufgenommen wird. Es zeigte sich, dass FHR-3 einen komplement-aktivierenden und pro-inflammatorischen Effekt auf ARPE-19 Zellen auslöste, stärker ausgeprägt in den alternden Zellen. Komplementkomponenten C3 (inklusive aktivierte Spaltprodukte), CFB und Komplementrezeptoren C3aR und CD11b wurden sowohl auf mRNA als auch auf Proteinebene erhöht exprimiert und sekretiert. Dieser Effekt war FHR-3-spezifisch und wurde nicht durch Behandlung der Zellen mit FHR-1, FH oder Properdin detektiert. In alternden ARPE-19 Zellen führte die FHR-3 Behandlung zum Priming des NLRP3-Inflammasoms, da die Genexpression von sowohl NLRP3als auch von pro-IL1B signifikant hochreguliert wurde. Die mRNA Expression von Toll-like Rezeptoren 1 und 3 (TLR1, TLR3), die einen protektiven Effekt auf RPE Zellen haben, erniedrigte sich signifikant in jungen und alternden ARPE-19 Zellen nach FHR-3 Inkubation. FHR-3 induzierte außerdem die Sekretion der pro-inflammatorischen Zytokine IL-6 und IL-18 in alternden ARPE-19. Des Weiteren veranlasste FHR-3 in ARPE-19 eine zeitabhängig verringerte Genexpression von Proteasom-Untereinheiten. Anschließend wurde in ersten Untersuchungen gezeigt, dass der hergestellte chimäre anti-FHR-3 Antikörper RETC-2-ximab den komplement-aktivierenden FHR-3 Effekt partiell mildern konnte auf RNA Ebene. Im letzten Teil dieser Arbeit konnten erste Ergebnisse gesammelt werden, die den komplement-aktivierenden Einfluss von FHR-3 auch auf RPE Zellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-RPE), und auf humane primäre RPE Zellen (pRPE) bestätigten. Zusammenfassend liefert diese Doktorarbeit neue Einblicke in die putative Funktion von FHR-3 im degenerierten, alternden Auge, insbesondere im Hinblick auf das endogene, intrazelluläre Komplementsystem in RPE Zellen. Mit RETC-2-ximab kann ein neuartiger FHR-3-blockierender lokaler Therapieansatz, v. a. im Hinblick auf die AMD-Pathogenese, geliefert werden.
Translation of the abstract (English)
The human complement system is an essential part of innate immunity, consisting of a precisely regulated interaction of more than 40 soluble and membrane-bound proteins. The main negative regulator of the complement system is complement factor H (FH). Since ten years, a polymorphism has been described in the CFH-related genes CFHR3 and CFHR1 inducing a gene deletion (ΔCFHR3/1), which is ...
Translation of the abstract (English)
The human complement system is an essential part of innate immunity, consisting of a precisely regulated interaction of more than 40 soluble and membrane-bound proteins. The main negative regulator of the complement system is complement factor H (FH). Since ten years, a polymorphism has been described in the CFH-related genes CFHR3 and CFHR1 inducing a gene deletion (ΔCFHR3/1), which is associated with a protective effect for the development of age-related macular degeneration (AMD). AMD is a multifactorial senile retinal disease that can lead to severe visual impairment and blindness. The pathomechanisms of AMD and the extent to which the complement proteins FHR-3 and FHR-1 are involved in the development and course of the disease are not completely understood. Therefore, the aim of this PhD thesis was to determine and modulate the function of FHR-3 and FHR-1 by using specific monoclonal antibodies (mAb). Hereby, the effect of the antibodies on both the systemic and intraocular complement systems should be investigated. This work could offer a novel antibody-based treatment option for the inflammatory processes in retinal diseases such as AMD. First, the monoclonal antibodies generated in the master thesis, targeting a peptide in the fifth C-terminal domain (SCR 5) of FHR-3, were fully characterized. RETC-2 was selected as highly specific for human FHR-3. RETC-2 detected both recombinant FHR-3 and native FHR-3 from human serum. Using this antibody, FHR-3 could be quantified in sera of various autoimmune diseases showing a significant increase of the target protein rheumatic autoimmune diseases. A systemic influence of FHR-3 on AMD was not observed. However, RETC-2 stained locally expressed FHR-3 in macrophage/microglia cells of a 92-year-old degenerated human retina. Since complement proteins and peroxidation products are deposited in the aged retina, the local effect of FHR-3 and the inhibitory effect of RETC-2 were analyzed. FHR-3 competed with FH for binding to both C3b and oxidative stress epitopes CEP (ω-carboxyethyl)pyrrole, MDA (malondialdehyde) and MAA (malondialdehyde acetaldehyde). Thus, FHR-3 acts as an indirect activator of the complement system by impairing FH function. RETC-2 inhibited these interaction and improved FH homeostasis in vitro. In the next project of this work, monoclonal antibodies against human FHR-1 were generated. Five clones were isolated that specifically targeted an immunogenic peptide in the SCR 3 domain of FHR-1. Of these, one clone 472 detected both recombinant FHR-1 and native FHR-1 from human serum. However, mAb 472 cross reacted with recombinant human FHR-3 in ELISA. Immunoprecipitation from human serum using mAb 472 and subsequent mass spectrometry analysis confirmed the specific interaction of FHR-1 with mAb 472. Since the promising results of the anti-FHR-3 antibody RETC-2 indicated a local effect of FHR-3 in the human eye, following experiments focused mainly on that antibody and the intraocular effect of its specific antigen. In a next step, chimerization of the FHR-3-binding antibody was performed due to the immunoreactive and complement activating properties of the murine IgG2b Fc part of RETC-2. First, the variable antibody regions of RETC-2 were amplified and cloned into commercial vector constructs expressing non-complement activating human IgG4 constant antibody regions. Subsequently, the chimerized antibody RETC-2-ximab was expressed by co-transfection in HEK293T cells and purified using protein G affinity chromatography. ELISA and Western blot successfully tested a specific binding of RETC-2-ximab to FHR-3. The last substantial project of this work dealt with the putative effect of FHR-3 on human RPE cells. RPE cells do not express CFHR3. First, the cultivation of the RPE cell line ARPE-19 was optimized. Evidence showed that aging ARPE-19 cells of passage 38 (P38) were in epithelial-mesenchymal transition (EMT) compared to young ARPE-19 cells (P25). On the one hand, tight junctions were weaker expressed and no compact apical F-actin rings could be detected. On the other hand, mesenchymal marker genes for vimentin, α-actin and type I collagen ere significantly upregulated in aging ARPE-19 cells. Both ageing and young ARPE-19 were apically incubated with recombinant FHR-3 under serum-free conditions. FHR-3 was found to be ingested by ageing ARPE-19 cells. FHR-3 was shown to trigger a complement activating and pro-inflammatory effect on ARPE-19 cells, especially in senescent cells. Increased expression and secretion of complement components C3 (including activated cleavage products), CFB and complement receptors C3aR and CD11b were observed at both mRNA and protein levels. While this effect was FHR-3 specific, it was not detected by treating the cells with FHR-1, FH or Properdin. In senescent ARPE-19, FHR-3 treatment triggered priming of the NLRP3 inflammasome due to upregulated gene expression of both NLRP3and pro-IL1B. Additionally, mRNA expression of toll-like receptors 1 and 3 (TLR1,TLR3) were significantly reduced in juvenile and senile ARPE-19 cells following FHR-3 incubation. FHR-3 also induced secretion of pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-18 in ageing ARPE-19. Furthermore, FHR-3 caused time-dependently decreased gene expression of proteasome subunits in ARPE-19. Thereafter, initial studies showed that the chimeric anti-FHR-3 antibody RETC-2-ximab could partially attenuate the complement activating FHR-3 effect on RNA level. The last part of this work showed preliminary results confirming the complement-activating impact of FHR-3 even on RPE cells from human induced pluripotent stem cells (iPS-RPE), and on human primary RPE cells (pRPE). In summary, this PhD thesis provides new insights into the putative function of FHR-3 in the degenerated elderly eye, especially concerning the endogenous intracellular complement system in RPE cells. RETC-2-ximab can potentially offer a novel FHR-3-blocking therapy strategy, especially with regard to AMD pathogenesis or other autoimmune diseases.
Metadata last modified: 10 Jun 2021 07:09
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