| License: Creative Commons Attribution 4.0 (6MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-477410
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.47741
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 4 August 2021 |
| Referee: | Prof. Dr. Martin Proescholdt |
| Date of exam: | 19 July 2021 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Neurochirurgie |
| Keywords: | Malignes Gliom; Glioblastom; Carboanhydrase IX; Hypoxie-induzierte Invasion; malignant glioma; glioblastoma; carbonic anhydrase IX; hypoxia induced invasion; Glioblastoma cell lines; BTIC; |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 47741 |
Abstract (English)
Objective: GBM (glioblastoma multiforme) is the most common and devastating primary tumor in central nervous system. The patient with GBM has an exceptionally poor prognosis. Heterogeneous and invasive nature of GBM makes it impossible to be cured by current treatment. GBM is also characterized by cellular metabolism reprogramming and TME (tumour microenvironment) acidification as well as ...
Abstract (English)
Objective: GBM (glioblastoma multiforme) is the most common and devastating primary tumor in central nervous system. The patient with GBM has an exceptionally poor prognosis. Heterogeneous and invasive nature of GBM makes it impossible to be cured by current treatment. GBM is also characterized by cellular metabolism reprogramming and TME (tumour microenvironment) acidification as well as intratumoral hypoxia. CAIX (carbonic anhydrase IX) is overexpressed in GBM but not in normal brain tissue. The characteristics of specific expression, hypoxia inducible, high catalytic activity and extracellular membrane location of CAIX are hypothesized to make it an important factor to mediate the extrusion of intracellular hydrogen ions into the extracellular space for TME acidification followed by the enhanced invasion of GBM cells. The expression of CAIX and invasion of GBM cells are also demonstrated to be enhanced under hypoxia. Therefore, CAIX is supposed to be a specific target for GBM cell invasion especially under hypoxia. The purpose of this study is to investigate the role of CAIX on GBM cell invasion under hypoxia.
Methods: The role of CAIX was investigated in vitro by using two established GBM cell lines, two mesenchymal and two proneural BTICs (brain tumour initiating cells). They were cultured in DMEM and RHB-A stem cell medium, respectively. The DMEM of 4.5g/L glucose was used because it had the same glucose concentration as RHB-A. Various hypoxia induction methods and two cell harvesting methods were examined first to optimize the experimental procedure. Low confluence and Wortmannin inhibition experiments were performed to test the influence of CAIX expression by cell culture density and PI3K (phosphoinositide 3-kinases) pathway under normoxia. Later, the expression of CAIX was examined in all six cell lines under both normoxia and hypoxia, and two single-isoform VEGFs (vascular endothelial growth factors) were also tested to validate the experimental condition of hypoxia. Cell immunofluorescence staining was performed to specifically test the expression of membrane protein CAIX under normoxia and hypoxia. Cell viability experiment was conducted by treating cells with different concentration of a specific inhibitor of extracellular carbonic anhydrases (termed U104) to find the optimized concentration and action days for invasion assay before cell death occurs. At last, cell invasion was investigated by Matrigel coated Transwell chamber and with or without CAIX inhibitor under normoxia and hypoxia.
Results: Gassing nitrogen up to the medium in T75 flask directly was the best way for hypoxia induction. Accutase/Trypsin method was superior to scraper method for cell harvest in this study. All cell lines expressed very low mRNA and baseline protein of CAIX under various confluence states and normoxia apart from the high expression of CAIX mRNA in U87 under high confluence culture. CAIX could be downregulated by PI3K inhibitor Wortmannin in most cell lines under normoxia. Results of normoxia and hypoxia experiment showed increased mRNA expression of CAIX/VEGF165/VEGF121 in all 6 cell lines after 24-hour sustained hypoxia. Experimental results also showed significantly increased protein expression of CAIX in two established cell lines, mildly increased expression in BTIC13/17/18 and no significant change in BTIC12 under 24-hour sustained hypoxia. Cell immunofluorescence staining illustrated that all GBM cell lines had a baseline expression of CAIX protein under normoxia, as well as increased protein expression in established cell lines and BTICs respectively to various degrees under hypoxia. Cell viability experiment revealed a dose and exposure time dependent toxic effect of U104 in all cell lines. Hypoxia increased cell viability only in specific cell lines (U87 and BTIC13) and experimental conditions. U87 and BTIC18 were less sensitive to U104 in comparing with other cell lines. Matrigel coated Transwell assay for cell invasion presented high heterogeneity between cell lines and in identical experimental condition of same cell line. All cell lines showed reduced invasion ability after serial passages. Hypoxia increased cell invasion only in specific cell lines (U87 and BTIC12) and experimental conditions. No obvious morphological changes of invaded cells could be observed between different treatment groups as well as normoxia and hypoxia in same cell line under optical microscope. Mesenchymal BTICs showed much higher invasion ability than other cell lines. CAIX inhibitor U104 reduced invasion only in mesenchymal BTICs.
Conclusions: Most GBM cell lines are regulated by PI3K pathway rather than cell confluence for the baseline expression of CAIX under normoxia on transcription and translation levels. The expression of CAIX mRNA is strongly induced by hypoxia in all cell lines. While the protein expression of CAIX is significantly induced by hypoxia only in established cell lines, this may attribute to the protein stability post-transcriptionally. U104 may be used as a targeted drug for treatment of GBM cells. The inhibition of CAIX is also a potential metabolic target for the invasion repression of GBM cells but only in mesenchymal BTICs.
Translation of the abstract (German)
Einführung: Das Glioblastoma (GBM) ist der häufigste und bösartigste Primärtumor im zentralen Nervensystem. Patienten mit einem GBM haben eine außergewöhnlich schlechte Prognose. Die heterogene und invasive Natur des GBM macht eine Heilung durch die derzeitige Behandlung unmöglich. GBM ist außerdem durch eine Reprogrammierung des zellulären Stoffwechsels, einer Ansäuerung des Tumor ...
Translation of the abstract (German)
Einführung: Das Glioblastoma (GBM) ist der häufigste und bösartigste Primärtumor im zentralen Nervensystem. Patienten mit einem GBM haben eine außergewöhnlich schlechte Prognose. Die heterogene und invasive Natur des GBM macht eine Heilung durch die derzeitige Behandlung unmöglich. GBM ist außerdem durch eine Reprogrammierung des zellulären Stoffwechsels, einer Ansäuerung des Tumor Microenvironments (TME) sowie einer intratumoralen Hypoxie gekennzeichnet. Die Carboanhydrase IX (CAIX) ist in GBM überexprimiert, nicht aber in normalem Hirngewebe. Es wird angenommen, dass die spezifischen Eigenschaften der CAIX, nämlich der tumor-spezifischen Expression, der hohen katalytischen Aktivität sowie der extrazellulären Membranlokalisation dieses Enzym zu einem wichtigen Faktor machen, der die Extrusion von intrazellulären Wasserstoffionen in den extrazellulären Raum für die TME-Azidifizierung vermittelt, was zu einer verstärkten Invasion von GBM-Zellen führen könnte. Die Expression von CAIX und die Invasion von GBM-Zellen sind unter Hypoxie nachweislich erhöht. Daher wird hypothetisiert, dass CAIX ein spezifisches Ziel für die Invasion
von GBM-Zellen insbesondere unter Hypoxie darstellen kann. Das Ziel dieser Studie ist es, die Rolle von CAIX auf die GBM-Zellinvasion unter Hypoxie zu untersuchen.
Methoden: Die Rolle von CAIX wurde in vitro untersucht, indem zwei etablierte GBM-Zelllinien, zwei mesenchymale und zwei proneurale BTICs (brain tumour initiating cells), verwendet wurden. Sie wurden in DMEM bzw. RHB-A Stammzellmedium kultiviert. Das DMEM mit 4,5g/L Glukose wurde verwendet, weil dies die identische Glukosekonzentration im Vergleich zu RHB-A darstellt. Zur Optimierung des Versuchsablaufs wurden zunächst
verschiedene Hypoxie-Induktionsmethoden und zwei Methoden zur Zellernte untersucht. Experimente mit niedriger Konfluenz und Wortmannin-Inhibition wurden durchgeführt, um den Einfluss der CAIX-Expression durch die Zellkulturdichte und den PI3K (Phosphoinositid-3-Kinasen)-Signalweg unter Normoxie zu testen. Anschliessend wurde die Expression von CAIX in allen sechs Zelllinien sowohl unter Normoxie als auch unter Hypoxie untersucht, als Vergleich wurden zwei Isoformen von VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) ebenfalls getestet, um die experimentelle Bedingung der Hypoxie zu validieren. Zell-Immunfluoreszenzfärbung wurde durchgeführt, um die Expression des membranständigen Proteins CAIX unter Normoxie und Hypoxie spezifisch zu testen. Das Zellviabilitätsexperiment wurde durchgeführt, indem die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen eines spezifischen Inhibitors der extrazellulären Carboanhydrasen (U104) behandelt wurden, um die optimale Konzentration und die Einwirkungstage für den Invasionstest zu finden, bevor der Zelltod eintritt. Schließlich wurde die Zellinvasion in einer mit Matrigel beschichteten Transwell-Kammer und
mit oder ohne CAIX-Inhibitor unter Normoxie und Hypoxie untersucht.
Ergebnisse: Die direkte Zugabe von reinem Stickstoff in das Medium in T75-Flaschen war die beste Methode zur Hypoxie-Induktion. Die Accutase/Trypsin-Methode war der Scraper-Methode zur Zellernte in dieser Studie überlegen. Alle Zelllinien exprimierten sehr geringe mRNA und
Basisprotein von CAIX unter verschiedenen Konfluenzzuständen und Normoxie, mit Ausnahme der hohen Expression von CAIX mRNA in U87 unter Hochkonfluenzkultur. CAIX konnte durch den PI3K-Inhibitor Wortmannin in den meisten Zelllinien unter Normoxie herunterreguliert werden. Die Ergebnisse der Normoxie- und Hypoxie-Experimente zeigten eine erhöhte
mRNA-Expression von CAIX/VEGF165/VEGF121 in allen 6 Zelllinien nach 24 Stunden anhaltender Hypoxie. Die experimentellen Ergebnisse zeigten auch eine signifikant erhöhte Proteinexpression von CAIX in zwei etablierten Zelllinien, eine leicht erhöhte Expression in BTIC13/17/18 und keine signifikante Veränderung in BTIC12 unter 24-stündiger anhaltender
Hypoxie. Die Zell-Immunfluoreszenz-Färbung zeigte, dass alle GBM-Zelllinien eine Grundexpression des CAIX-Proteins unter Normoxie hatten, sowie eine erhöhte Proteinexpression in etablierten Zelllinien bzw. BTICs in unterschiedlichem Ausmaß unter Hypoxie. Das Zellviabilitätsexperiment zeigte eine dosis- und expositionszeitabhängige toxische Wirkung von U104 in allen Zelllinien. Hypoxie erhöhte die Zellviabilität nur bei bestimmten
Zelllinien (U87 und BTIC13) und experimentellen Bedingungen. U87 und BTIC18 waren im Vergleich zu den anderen Zelllinien weniger empfindlich gegenüber U104. Der Matrigel-beschichtete Transwell-Assay für die Zellinvasion zeigte eine hohe Heterogenität zwischen den Zelllinien und bei identischen experimentellen Bedingungen derselben Zelllinie. Alle Zelllinien zeigten eine reduzierte Invasionsfähigkeit nach seriellen Passagen. Hypoxie
erhöhte die Zellinvasion nur bei bestimmten Zelllinien (U87 und BTIC12) und experimentellen Bedingungen. Unter dem Lichtmikroskop konnten keine offensichtlichen morphologischen Veränderungen der invadierten Zellen zwischen verschiedenen Behandlungsgruppen sowie Normoxie und Hypoxie in derselben Zelllinie beobachtet werden. Mesenchymale BTICs zeigten
eine viel höhere Invasionsfähigkeit als andere Zelllinien. Der CAIX-Inhibitor U104 reduzierte die Invasion nur bei mesenchymalen BTICs. Schlussfolgerungen: Die meisten GBM-Zelllinien werden durch den PI3K-Signalweg reguliert und nicht durch die Zellkonfluenz für die Grundexpression von CAIX unter Normoxie auf Transkriptions- und Translationsebene. Die Expression von CAIX mRNA wird durch Hypoxie in
allen Zelllinien stark induziert. Während die Proteinexpression von CAIX nur in etablierten Zelllinien durch Hypoxie signifikant induziert wird, könnte dies auf die posttranslationale Stabilisierung des Proteins hinweisen. U104 könnte als gezielte Substanz zur Behandlung des GBM eingesetzt werden, da die Inhibition von CAIX ein metabolisches Ziel bei der Inhibition von GBM Invasion darstellen könnte, jedoch primär bei mesenchymal differenzierten Tumoren.
Metadata last modified: 04 Aug 2021 10:30
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