| License: Publishing license for publications excluding print on demand (16MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-492373
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.49237
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 7 October 2021 |
| Referee: | PD Dr. Hans-Heiner Gorris |
| Date of exam: | 30 April 2021 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Chemo- und Biosensorik (Prof. Antje J. Bäumner, formerly Prof. Wolfbeis) |
| Keywords: | Upconversion Nanoparticles, Immunoassay, Immunocytochemistry, Enzyme kinetics, Single-molecule |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 49237 |
Abstract (English)
This thesis builds on photon-upconversion nanoparticles (UCNPs) as background-free luminescent labels in bioaffinity assays using antibodies as recognitions elements. UCNPs are nanocrystals that can absorb two or more near-infrared (NIR) photons and emit light with higher energy (anti-Stokes emission). The NIR excitation drastically reduces the measurement background by avoiding autofluorescence ...
Abstract (English)
This thesis builds on photon-upconversion nanoparticles (UCNPs) as background-free luminescent labels in bioaffinity assays using antibodies as recognitions elements. UCNPs are nanocrystals that can absorb two or more near-infrared (NIR) photons and emit light with higher energy (anti-Stokes emission). The NIR excitation drastically reduces the measurement background by avoiding autofluorescence and minimizing light scattering. Together with a high photostability and constant emission (no blinking), UCNPs have become an excellent label for many bioanalytical applications. The aim of this work was to develop UCNP-based assays with the possibility to perform a single-molecule (digital) readout.
The first part of the thesis describes the development of immunoassays from a historical perspective and explains the fundamental building blocks needed for affinity assays. Various assay formats are described. The structure, function, and preparation of antibodies is explained. Alternative recognition labels like aptamers and molecularly imprinted polymers (MIPs) are critically discussed, and important label types are examined in detail. Cornerstones in the immunoassay development are highlighted using selected examples from the literature. The definition, advantages, and challenges of digital (single-molecule) affinity assays are discussed with respect to different label types, such as enzymes, small molecular labels, and nanoparticles.
The first research article describes the development of an immunoassay for counting individual molecules of the cancer biomarker prostate-specific antigen (PSA) with UCNPs coupled to an anti-PSA antibody. Individual UCNPs bound to a PSA molecule were visualized using a modified epifluorescence microscope that was equipped with a 980 nm-laser. The PSA concentration was determined in a digital way by counting the number of luminescent spots visible in a defined area of the microplate. Synthesis of the detection conjugate was optimized with respect to minimizing the aggregation of the nanoparticles, and the quality was controlled using agarose gel electrophoresis.
The digital upconversion-linked immunosorbent assay (ULISA) reached a low limit of detection (LOD) of 1.2 pg/mL (42 fM) and covered three orders of magnitude for PSA spiked in 25% blood serum, which was approximately 10× more sensitive than commercial ELISA kits. It was demonstrated that the digital readout is superior to the conventional analog readout of the same microtiter plate using a plate reader equipped with a 980 nm-laser, which resulted in an LOD of 20.3 pg/mL (700 fM, 17× higher LOD). A combination of both readout methods increased the working range to four orders of magnitude from 1 pg/mL to 10,000 pg/mL. The compatibility with standard microplate assay procedures and the high sensitivity make the ULISA a powerful alternative to existing assays and will have a substantial impact in the future.
The second research article focused on the surface modification of UCNPs to reduce non-specific binding, while simultaneously increasing the sensitivity of the PSA detection by exploiting the strong affinity of streptavidin towards biotin. A linker consisting of neridronate, a bisphosphonate that strongly coordinates to lanthanide ions, was chosen to anchor a long polyethylene glycol (PEG) spacer with an incorporated alkyne group at the other end. The alkyne group was used for the covalent immobilization of streptavidin azide onto the UCNPs, via a copper-catalyzed click reaction.
Like the ULISA with antibody-UCNP conjugates, the digital ULISA with streptavidin-PEG-UCNPs improved the analog readout by a factor of 16. The strong affinity between biotin and streptavidin led to a 50× higher sensitivity compared to the former assay, which led to a subfemtomolar LOD of 800 aM (~50,000 PSA molecules in 100 µL sample) in 25% blood serum. The results obtained for real patient samples were in excellent agreement with results obtained from a standard method based on electrochemiluminescence (Elecsys, Roche).
In Research article 3, the unique photophysical properties of UCNPs were exploited for the immunochemical labeling of a cancer marker on the surface of cells. We demonstrated that UCNP labeling is compatible with standard fluorescence labeling techniques but achieves unsurpassed signal to background ratios. We designed and characterized three different SA-UCNP conjugates and compared the results with a standard fluorescence-based readout using SA conjugated to 5(6)-carboxyfluorescein (SA-FAM).
It was found that our previously established SA-PEG-neridronate-UCNPs showed the highest specific binding and, at the same time, the lowest non-specific signal among the three tested SA-UCNP conjugates. The signal-to-background ratio of SA-PEG-neridronate-UCNPs was 319, a 50-fold increase compared to the SA-FAM conjugate (signal to background of 6). Control experiments confirmed the specificity of the UCNP staining. The results demonstrated that UCNPs are a valuable addition to the existing repertoire of immunochemical labeling techniques.
Research article 4 focuses on the analysis of enzyme kinetics at the single-molecule level. This research is closely related to the digital immunoassay established by the company Quanterix (Chapter IV.6.2). The conventional transition state theory (TST) is used to analyze and explain the reaction rates of enzymes. However, it does not account for static heterogeneity and dynamic effects in proteins, revealed by single-molecule measurements. We analyzed the reaction rates of individual β-D-galactosidase (GAL) and β-D-glucuronidase (GUS) molecules in large arrays of femtoliter-sized wells, revealing a static heterogeneity. The reaction rate distributions gave access to the intrinsic distributions of the free energy of activation (ΔG‡) of GAL and GUS.
A broader distribution of ΔG‡ was found for GAL than for GUS, which is potentially caused by the multiple catalytic reaction pathways of GAL as a hydrolase and transglycosylase. Different catalytic reactions of GAL require more catalytically potent conformations for individual enzyme molecules in the enzyme population compared to GUS. Reaction rates of single enzyme molecules do not change over time (10 min). This indicates that each enzyme molecule has a broader set of conformations than it can access during catalysis. We adapted the TST for these findings by assuming transition state ensembles that can not only drive the enzymatic catalysis but also channel the reaction pathway.
The aim of this thesis was to employ UCNPs as labels for highly sensitive immunoassays. With the first two research articles, the digital ULISA was successfully introduced and set the foundation for a new generation of digital immunoassays. It was further shown that UCNPs are exceptional labels for the immunochemical labeling of cells. Especially the low background of the UCNP label could have significant impact on tissue diagnostics in the (near) future.
Translation of the abstract (German)
Die vorliegende Arbeit basiert auf der Verwendung von Photonen-aufkonvertierenden Nanopartikeln (engl.: photon-upconversion nanoparticle, UCNP) als optische Markierungen in Antikörper-basierten Bioaffinitätstests (oder Bioaffinitätsassays). UCNPs sind Nanokristalle, die zwei oder mehrere Photonen im Nahinfrarotbereich (NIR) absorbieren und daraufhin Licht mit höherer Energie emittieren ...
Translation of the abstract (German)
Die vorliegende Arbeit basiert auf der Verwendung von Photonen-aufkonvertierenden Nanopartikeln (engl.: photon-upconversion nanoparticle, UCNP) als optische Markierungen in Antikörper-basierten Bioaffinitätstests (oder Bioaffinitätsassays). UCNPs sind Nanokristalle, die zwei oder mehrere Photonen im Nahinfrarotbereich (NIR) absorbieren und daraufhin Licht mit höherer Energie emittieren (anti-Stokes Emission). Durch die NIR Anregung wird die Autofluoreszenz der Matrix unterdrückt und die Streuung des Anregungslichtes minimiert, so dass der Messhintergrund drastisch reduziert wird. In Kombination mit der hohen Photostabilität und konstanten Emission (kein Blinken) sind UCNPs zu hervorragenden Markierungen für viele bioanalytische Anwendungen geworden. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von UCNP-basierten Assays, die zudem die Möglichkeit zum Einzelmolekülnachweis von Analyten bieten (digitales Auslesen).
Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt die Entwicklung von Immunoassays aus historischer Sicht und erklärt die grundlegenden Bestandteile, die für Affinitätsassays benötigt werden. Es werden verschiedene Formate von Immunoassays beschrieben. Die Struktur, Funktion und Herstellung von Antikörpern wird erläutert, zudem werden alternative Erkennungselemente wie Aptamere und molekular geprägte Polymere (engl.: molecularly imprinted polymers, MIPs) ausführlich diskutiert. Besondere Meilensteine in der Entwicklung von Immunoassays werden unter Verwendung von ausgewählten Beispielen aus der Literatur hervorgehoben. Die Definition, Vorteile und Herausforderungen von digitalen (Einzelmolekül) Affinitätsassays werden anhand von verschiedenen Markierungsarten wie Enzymen, molekularen Markern und Nanopartikeln diskutiert.
Die erste Originalarbeit beschreibt die Entwicklung eines Immunoassays, der auf dem Zählen einzelner Moleküle des Krebsmarkers Prostata-spezifisches Antigen (PSA) beruht. Individuelle UCNPs, die an PSA Moleküle gebunden waren, wurden unter einem modifizierten Epifluoreszenzmikroskops, das mit einem 980 nm-Laser ausgestattet wurde, sichtbar gemacht. Anschließend wurde die PSA-Konzentration digital ermittelt, indem die Anzahl an lumineszenten Punkten in einem definierten Bereich eines Mikrowells gezählt wurde. Die Synthese der Nachweismarkierungen wurde optimiert, um die Aggregation der Partikel zu minimieren, und die Qualität der Konjugate wurde durch Agarose-Gelelektrophorese kontrolliert.
Der UCNP-basierte digitale Immunoassay (engl.: upconversion-linked immunosorbent assay, ULISA) erreichte eine Nachweisgrenze (engl.: limit of detection, LOD) von 1,2 pg/mL (42 fM) in 100 μL Probenvolumen und ermöglichte es, die PSA Konzentration über einen Bereich von drei Größenordnungen in 25% Blutserum zu bestimmen. Damit war der digitale ULISA ca. 10× sensitiver als kommerzielle ELISA-Tests. Um den Vorteil des digitalen Auslesens zu zeigen, wurde der PSA Assay zudem mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät, welches mit einem 980 nm-Laser ausgestattet war, gemessen (analoges Auslesen). Die analoge Auslesemethode erreichte eine LOD von 20,3 pg/mL (700 fM) und war somit 17× höher, als das digitale Zählen der Partikel. Eine Kombination beider Auslesemethoden vergrößerte den Arbeitsbereich des Assays auf vier Größenordnungen von 1 pg/mL bis 10.000 pg/mL. Die Kompatibilität mit herkömmlichen Assayprotokollen und die hohe Sensitivität machen den ULISA zu einer vielversprechenden Alternative zu etablierten Immunoassays.
Die zweite Originalarbeit konzentriert sich auf die Oberflächenmodifikation von UCNPs, um gleichzeitig die unspezifische Bindung der Partikel zu reduzieren und die Sensitivität der PSA-Bestimmung weiter zu verbessern. Dabei wurde die starke, nicht-kovalente Interaktion zwischen Streptavidin (SA) und Biotin ausgenutzt. Zunächst wurde ein langer Polyethylenglykol (PEG)-Linker synthetisiert, der an einem Ende ein Bisphosphonat (Neridronat) trug und an dem anderen ein Alkin. Das Bisphosphonat diente dabei als Anker zwischen dem PEG und dem UCNP, da es eine starke Komplexbindung zu den Lanthanoid-Ionen an der Oberfläche des Partikels ausbilden kann. Die Alkin-Gruppe wurde dann für die kovalente Immobilisierung von SA durch eine Kupfer-katalysierte Click-Reaktion mit SA-Azid verwendet.
Wie der zuvor beschriebene ULISA, verbesserte auch hier die digitale Auslesemethode den analogen Modus um einen Faktor von 16. Die starke Interaktion zwischen den SA-PEG-neridronat-UCNPs und Biotin führte zu einer 50× höheren Sensitivität, im Vergleich zum ULISA mit Antikörper-gekoppelten UCNPs, was eine LOD im sub-femtomolaren Bereich ermöglichte (800 aM, ~50.000 PSA Moleküle in 100 µL, in 25% Blutserum). Der ULISA mit Serumproben echter Patienten zeigte eine hervorragende Korrelation mit einer Referenzmethode, die auf Chemilumineszenz beruhte (Elecsys, Roche).
In der dritten Originalarbeit wurden die einzigartigen photophysikalischen Eigenschaften von UCNPs für die spezifische Markierung eines Brustkrebsmarkers an der Oberfläche von Zellen genutzt. Es wurde gezeigt, dass das spezifische Anfärben mit SA-funktionalisierten UCNPs kompatibel mit konventionellen Markierungsmethoden ist, jedoch ein unübertroffenes Signal-zu-Hintergrund Verhältnis bietet. Es wurden drei verschiedene SA-basierte UCNP Konjugate hergestellt und die Ergebnisse der immunochemischen Färbung mit einer fluoreszenten Verbindung aus SA und 5(6)-Carboxyfluorescein (SA-FAM) verglichen.
Die bereits zuvor beschriebenen SA-PEG-Neridronat-UCNPs zeigten die höchste spezifische Bindung und gleichzeitig das niedrigste unspezifische Signal unter den drei getesteten SA-UCNP Nachweisreagenzien. Somit konnte ein sehr hohes Signal-zu-Hintergrund Verhältnis von 319 erreicht werden, welches 50× höher war als die Standardmethode mit SA-FAM (Signal-zu-Hintergrund von 6). Kontrollexperimente mit Zelllinien, die den Krebsmarker nur geringfügig exprimieren, bestätigten die Spezifität der SA-PEG-Neridronat-UCNPs. Die Ergebnisse zeigen, dass UCNPs eine vielversprechende Erweiterung zum bereits bestehenden Portfolio an Markierungstechniken für die Immunhistochemie darstellen.
Die vierte Originalarbeit beschäftigt sich mit Enzymkinetiken auf der Einzelmolekülebene. Diese Arbeit ist eng mit dem digitalen Immunoassay der Firma Quanterix (Kapitel IV.6.2) verwandt. Die konventionelle Theorie des Übergangszustandes (engl.: transition state theory, TST) wird verwendet, um die Reaktionsgeschwindigkeiten von Enzymen zu bestimmen. Jedoch berücksichtigt die konventionelle TST weder die statische Heterogenität noch dynamische Effekte innerhalb einer Enzympopulation, die durch Einzelmolekülexperimente nachgewiesen worden sind. In dieser Arbeit wurden einzelne Moleküle der β-D-Galactosidase (GAL) und β-D-Glucuronidase (GUS) in Arrays, die aus zehntausenden Femtoliter-großen Wells bestehen, eingeschlossen und deren Reaktionsraten analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass eine statische Heterogenität in den Geschwindigkeiten der Enzyme innerhalb einer Population vorliegt. Die Verteilung der Reaktionsraten wurde verwendet, um die intrinsischen Verteilungen der freien Aktivierungsenergie (ΔG‡) von GAL und GUS zu bestimmen.
GAL zeigte eine breitere Verteilung von ΔG‡ als GUS, was darauf zurückzuführen sein könnte, dass GAL mehrere katalytische Funktionen aufweist als GUS. So kann GAL neben der hydrolytischen Spaltung von Laktose, auch die Transglycosylierung von Laktose zu Allolaktose katalysieren. Diese verschiedenen Funktionalitäten benötigen—im Gegensatz zu GUS—mehr katalytisch aktive Konformationen, die einzelne GAL-Moleküle innerhalb einer Population einnehmen können. Da die Reaktionsraten einzelner Enzymmoleküle über einen langen Zeitraum (10 min) konstant sind, lässt sich daraus schließen, dass jedes Enzymmolekül eine größere Ausstattung an möglichen Konformationen besitzt, als es während der Katalyse einnehmen kann. Die TST wurde insoweit angepasst, dass TST Ensembles nicht nur die enzymatische Katalyse, sondern auch deren potentielle Reaktionswege berücksichtigen.
Das Ziel dieser Arbeit war es UCNP-basierte Nachweisreagenzien für hochsensitive Immunoassays zu entwickeln. Mit den ersten beiden Artikeln wurde der nachweisstarke digitale ULISA eingeführt und legte den Grundstein für eine neue Generation von digitalen Immunoassays. Im dritten Artikel wurde die Vielseitigkeit der synthetisierten UCNP-Markierungen anhand des immunochemischen Nachweises von Krebsmarkern auf Zellen gezeigt. Besonders das hohe Signal-zu-Hintergrund Verhältnis von UCNPs könnte künftig einen starken Einfluss auf die Histologie haben.
Metadata last modified: 07 Oct 2021 07:49
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