| License: Creative Commons Attribution 4.0 (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-494092
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.49409
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 25 November 2021 |
| Referee: | Prof. Dr. Herbert Jägle and Prof. Dr. Antje Grosche |
| Date of exam: | 27 September 2021 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Augenheilkunde Medicine > Lehrstuhl für Humangenetik |
| Projects (Historical): | Programme Blanc der Agence Nationale de la Recherche (ANR): "Funktion von VAMP-Proteinen in Gliazellen", Pro-Re/Seed/Grosche.1-2014 |
| Keywords: | Müllerzellen, Gliotransmission, Exosomen, VAMP5, VGLUT3, VAMP, VGLUT, SNARE, Retina, retinale Mikroglia, retinale Neurone, retinale Endothelzellen, Amakrinzellen, VAMP7-KO-Maus, iBot-Maus, MACS®, Müller cells, exosomes, VAMP7-KO-mouse, iBot-mouse |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 49409 |
Abstract (German)
In meiner Doktorarbeit wurden vesikuläre Sekretionsmechanismen in Müllerzellen anhand der hierfür nötigen molekularen Grundlagen erforscht sowie neue Aussagen über Mikrogliazellen, Neuronen und Endothelzellen der Retina getroffen. Dies erfolgte mittels histologischer Präparationen, Immunfluoreszenzfärbungen, Konfokalmikroskopie, MACS®-Technik, RNA-Isolationen, cDNA-Synthesen und ...
Abstract (German)
In meiner Doktorarbeit wurden vesikuläre Sekretionsmechanismen in Müllerzellen anhand der hierfür nötigen molekularen Grundlagen erforscht sowie neue Aussagen über Mikrogliazellen, Neuronen und Endothelzellen der Retina getroffen.
Dies erfolgte mittels histologischer Präparationen, Immunfluoreszenzfärbungen, Konfokalmikroskopie, MACS®-Technik, RNA-Isolationen, cDNA-Synthesen und Genotypisierungs-PCRs sowie TaqMan®-PCRs. Eingesetzt wurden außerdem Proteinisolationen, darunter auch die Membranproteingewinnung, weiterführende Western Blots, die Technik der Immunpräzipitation, die Zellkulturierung sowie Exosomenisolationen.
Erstmals wurden ein neu generiertes triple-transgenes Tier (Müllerzell-spezifischer Knockout von VAMP1-3, gekreuzt mit VAMP7-KO-Mäusen) sowie Müllerzellen im VAMP7-Knockout-Tier erforscht. Des Weiteren konnten das SNARE VAMP3 und erstmals auch VAMP5 sowie VAMP7 in der Mausretina auf Proteinebene nachgewiesen werden, VAMP5 erstmalig als Müllerzellprotein.
Ein Protokoll zur Müllerzellisolation aus der Netzhaut wurde weiterentwickelt und dessen Verlässlichkeit und Reproduzierbarkeit mit mehreren Methoden bewiesen, wodurch sich die Aussagekräftigkeit der darauf aufbauenden Analysen bestätigt und verbessert hat. Auf gleichem Wege ließen sich spezifisch auch die restlichen Zellfraktionen der Retina gewinnen und analysieren.
Hierdurch wurde die Aussage möglich, dass Mikrogliazellen der Netzhaut vermutlich alle VAMPs sowie VGLUT3 exprimieren. Der Knockout von VAMP7 bzw. der Müllerzell-spezifische Knockout von VAMP1-3 hatte in den untersuchten Tests keinen Einfluss auf die Mikrogliazellen, weder auf morphologischer bzw. histologischer Ebene noch in Bezug auf die Expression der verbleibenden VAMPs, VGLUT3 oder Zelltyp-spezifischer Marker. Die histologisch im Wildtyp gewonnenen Daten passen größtenteils zu den Ergebnissen bereits bestehender Literatur. Allerdings bestand entgegen dort beschriebener Zahlen in meinen Analysen kein Unterschied zwischen den Mikroglia-Zellzahlen in innerer und äußerer plexiformer Schicht und war in den Versuchen dieser Arbeit die in der Wildtyp-Maus von Mikroglia okkupierte Fläche in der inneren plexiformen Schicht größer als in der äußeren.
Auch die Endothelzellen der Mausnetzhaut schienen alle VAMPs, insbesondere VAMP4, zu exprimieren, und zwar unabhängig vom Genotyp der Maus.
Mikrogliaaktivierung ist eng mit einer Degeneration in der Retina assoziiert und endotheliale Aktivierung könnte an der Initiierung und Ausdehnung neurovaskulärer Erkrankungen beteiligt sein, sodass auf den hier dargestellten Daten aufbauende weiterführende Analysen therapeutische Ansatzpunkte in Bezug auf diese Erkrankungen liefern könnten.
Die Neuronen der Netzhaut exprimierten kein oder wenig VAMP5, ansonsten aber alle anderen VAMPs. Weder im VAMP7-Knockout noch im triple-transgenen Tier kam es zu kompensatorischen Expressionsveränderungen nicht targetierter VAMP-Isoformen. Die bereits bestehende Annahme, dass vor allem VGLUT1, aber auch VGLUT2 und VGLUT3 in Neuronen der Retina exprimiert werden, konnte in meiner Arbeit bestätigt werden. Unter den Neuronen scheinen die Amakrinzellen eine Sonderrolle einzunehmen, da sie auf histologischer Ebene als einzige mit einer reduzierten Zellzahl auf den Knockout von VAMP7 reagierten, was unabhängig vom Müllerzell-spezifischen Knockout anderer Gene war. Außerdem ist bereits gezeigt worden, dass sie wie die Müllerzellen VGLUT3 exprimieren. Dies gibt Anlass für ihre weitere Erforschung bezüglich ihrer Rolle in der Retina und den Interaktionen mit Müllerzellen, z. B. mittels gesonderter Isolation aus der Neuronenfraktion.
Müllerzellen der Netzhaut verfügen über nötige molekulare Grundlagen zur exozytotischen Vesikelfreisetzung von Glutamat, was Gliotransmission durch Müllerzellen entgegen kritischer Stimmen (Fiacco und McCarthy 2018) sehr wahrscheinlich macht. Dadurch können sie die Signalverarbeitung von Nervenzellen mutmaßlich direkt beeinflussen, beispielsweise im Sinne einer tripartiten Synapse. Eine Schlüsselrolle bei diesen molekularen Grundlagen scheinen Exosomen, VGLUT3 sowie VAMP3 und/oder VAMP5 zu spielen. Womöglich lassen sich diese Rückschlüsse auch auf andere Gliazellen des ZNS übertragen, da Müllerzellen als Modellglia fungieren können (Kapitel 1.2).
Erstmals wurde hier gezeigt, dass Müllerzellen alle drei VGLUTs exprimierten, und zwar insbesondere VGLUT3, dem eine Schlüsselrolle in der Kalzium-abhängigen Glutamatsekretion zugeschrieben wird.
Müllerzellen exprimierten im Vergleich zu Neuronen insbesondere VAMP5, und das unabhängig vom untersuchten Genotyp. VAMP5 scheint also eine Schlüsselrolle bei der Exozytose durch Müllerzellen zu spielen. Es befindet sich in vesikulären Strukturen, welche die Müllerzelle vermutlich sezerniert, die sie jedoch auch in ihren Endfüßen und gleichmäßig in der gesamten Zelle trägt. Außerdem scheint es viele Interaktionen mit anderen Proteinen einzugehen, die für sekretorische Prozesse benötigt werden. Mikrotubuli-assoziierte Proteine ko-präzipitierten ebenfalls mit VAMP5 und könnten Teil der Exozytose-Maschinerie in Müllerzellen sein. Ich konnte außerdem erstmals Syntaxin1B, SNAP91 und Proteine der Sec-Familie als mögliche t-SNAREs der VAMP5-vermittelten Kommunikation von Zellen mittels Transportvesikeln identifizieren, wobei NSF, Complexin IV, Synaptophysin, Synaptotagmin I, Syncrip (Synaptotagmin binding, cytoplasmic RNA interacting protein) und Septin 7 hierfür mögliche Hilfsproteine wären. Eine Validierung dieser vielfältigen Interaktionen sollte in weiterführenden Untersuchungen erfolgen.
Einige dieser mit VAMP5 ko-präzipitierten Proteine sind Exosomen-assoziiert. Außerdem zeigte sich eine Ko-Präzipitation von VAMP5 mit vielen weiteren Exosomen-assoziierten Proteinen, sodass letztlich erstmals postuliert werden kann, dass Müllerzell-Exozytose und somit Gliotransmission durch Müllerzellen Exosomen- und VAMP5-vermittelt ablaufen könnte. Die erfolgreiche Isolation von Exosomen aus Müllerzellkulturen und ihr erstmaliger Nachweis auf Proteinebene sowie in der Elektronenmikroskopie untermauern diese These ebenso wie die Tatsache, dass VAMP5 und Exosomen auf elektronenmikroskopischer Ebene kolokalisiert waren.
Somit leistet diese Dissertation auf Zell- und molekularer Ebene einen Beitrag zur weiteren Erforschung der Retina, der Müllerzelle und von Gliazellen im Allgemeinen sowie von Exosomen, VGLUTs und VAMPs.
Bedenkt man die in meiner Arbeit beschriebenen Daten, wird klar, dass nicht nur neuronale Prozesse, sondern auch die glialen Aktionen ein Angriffspunkt für das Verständnis und die Therapie neuronaler bzw. ophthalmologischer Erkrankungen sein können und sollten. Insbesondere Exosomen als zellfreies Vehikel könnten ungeahnt an pathologischen Prozessen und Krankheitsentstehung beteiligt sein und bieten einen vielversprechenden Ansatz als therapeutisches Werkzeug bei diesen Erkrankungen sowie gleichzeitig die Möglichkeit, der Grundlagenforschung in diesem Bereich den Weg zum medizinischen Nutzen zu ebnen.
Translation of the abstract (English)
This thesis gives new insights into the mechanisms of vesicular exocytosis from retinal Müller cells by investigating the molecular basics that are required for that. In addition, also new findings about retinal microglia, neurons and endothelial cells could be revealed. The applied techniques were histologic preparations, immunofluorescence stainings, confocal laser scanning microscopy, ...
Translation of the abstract (English)
This thesis gives new insights into the mechanisms of vesicular exocytosis from retinal Müller cells by investigating the molecular basics that are required for that. In addition, also new findings about retinal microglia, neurons and endothelial cells could be revealed. The applied techniques were histologic preparations, immunofluorescence stainings, confocal laser scanning microscopy, magnetic-activated cell sorting (MACS®), RNA isolation, cDNA synthesis, Genotyping PCR and TaqMan®-PCR, (membrane) protein isolation, Western blot, immunoprecipitation, cell culture and exosome isolation.
For the first time new generated triple-transgen mice (Müller cell specific knockout of VAMP1-3 crossed with VAMP7-KO-mice) and Müller cells of VAMP7-Knockout-mice were explored. Moreover the SNARE VAMP3 und for the first time also VAMP5 and VAMP7 could be detected as mouse retina protein, VAMP5 for the first time as Müller cell protein.
A protocol for the isolation of Müller cells, retinal microglia, neurons and endothelial cells from the retina by magnetic-activated cell sorting (MACS®) was improved and validated.
We found that retinal microglia and endothelial cells seem to express VAMP1-8, microglia also VGLUT3. Because retinal microglia activation is associated with retinal degeneration and as endothelial activation is involved in neurovascular diseases, my data could provide a basis for future analysis in these fields.
I could show that retinal neurons seem to express all VAMPs except for VAMP5 and all VGLUTs (VGLUT1-3). The Knockout of VAMP7 lead to an exclusive reduction of amacrine cells in histologic experiments for which reason the investigation of retinal amacrine cells and their interaction with Müller cells is an interesting link for future studies.
We found that retinal Müller cells possess the molecular basics that are required for vesicular exocytotic glutamate release (Exosomes, VGLUT3 and VAMP3 and/or VAMP5, see below) what makes gliotransmission by Müller cells very likely. Thus, Müller cells are probably capable to influence neuronal signal transduction directly, e.g. in terms of a so-called tripartie synapse. Because a Müller cell can be seen as a “glia cell model”, the here investigated Müller cell characteristics may also be applicable for other glia cells of the CNS.
For the first time we could show that Müller cells expressed all VGLUTs and in particular VGLUT3 what is an important factor in calcium-dependent exocytosis.
Compared to neurons Müller cells expressed especially VAMP5 and the VAMP5-expression was irrespective of the particular genotype. Altogether, VAMP5 seems to play a key role in Müller cell exocytosis. We could for the first time show that VAMP5 is located in vesicular structures that are probably secreted by Müller cells and that can be found in Müller cell endfeet as well as equably distributed in the whole cell (electron microscopy). In addition, immunoprecipitation data suggested that VAMP5 seems to interact with many other proteins that are required for secretory processes. Besides, for the first time we could identify Syntaxin1B, SNAP91 and proteins of the Sec-family as possible t-SNAREs in VAMP5-mediated cell-cell-communication. Potential supporting proteins for that could be NSF, Complexin IV, Synaptophysin, Synaptotagmin I, Syncrip (Synaptotagmin binding, cytoplasmic RNA interacting protein) and Septin 7. A validation of these manifold interactions in immunoprecipitation should be completed in future studies.
Many of the proteins that co-precipitated with VAMP5 are associated with exosomes. Overall, it could be postulated for the first time that the above-mentioned vesicular structures that contained VAMP5 could be exosomes and that gliotransmission by Müller cells could be exosome- and VAMP5-mediated. This hypothesis can be fortified by the fact that we could successfully isolate exosomes from Müller cell culture and detect them via Western blot and electron microscopy and that we could show that VAMP5 and exosomes were co-localized in electron microscopy.
In conclusion, this thesis contributes to the further exploration of the retina, the Müller cell and glia cells in common as well as exosomes, VGLUTs and VAMPs.
Taken together, all these hints point in the direction that not only the investigation of neuronal processes but also the exploration of glial actions is eminent to understand neuronal and ophthalmologic diseases and to develop suited therapies in these fields. Especially exosomes as cell-free vehicles could be involved in many pathologic processes and are thus offering a promising approach as therapeutic tool for these diseases.
Metadata last modified: 25 Nov 2021 07:44
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