| License: Creative Commons Attribution 4.0 (21MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-510465
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.51046
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 24 November 2021 |
| Referee: | Prof. Dr. Markus Feuerer |
| Date of exam: | 15 November 2021 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Immunologie |
| Keywords: | Immunology, Regulatory T-cells, wound healing |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 51046 |
Abstract (English)
Regulatory T cells (Tregs) are characterized by the expression of FOXP3 and are important for regulating other cellular components of the immune system. Their absence leads to autoimmune diseases like the “Scurfy phenotype” in mice or the Immunodysregulation, Polyendocrinopathy, Enteropathy, X-linked (IPEX) syndrome in humans. Non-lymphoid tissue (NLT) Tregs are distinct from lymphoid tissue (LT) ...
Abstract (English)
Regulatory T cells (Tregs) are characterized by the expression of FOXP3 and are important for regulating other cellular components of the immune system. Their absence leads to autoimmune diseases like the “Scurfy phenotype” in mice or the Immunodysregulation, Polyendocrinopathy, Enteropathy, X-linked (IPEX) syndrome in humans. Non-lymphoid tissue (NLT) Tregs are distinct from lymphoid tissue (LT) Tregs. Comparing the gene expression profile (transcriptome) and the DNA methylation profile (epigenome) of NLT vs LT Treg cells in mice, our lab identified transcription factors as well as other genes particularly enriched in NLT Tregs. This led to the identification of a tissue specific Treg subset in mice, characterized by the surface expression of Klrg1 and ST2, a TH2 biased gene program as well as their production of Amphiregulin, which has been shown to aid in tissue repair. In mouse, this program is driven by the Transcription factor Batf.
In this thesis, we worked to identify the human counterpart of this population. We established methods to isolate T-cells from tissues, and when this was optimised, performed the Assay for Transposase Accessible Chromatin following Sequencing (ATAC-seq) on a single cell level (scATAC-seq) to identify changes in chromatin accessibility on murine and human CD4+ T-cells. We found that this was a good and reliable method to identify different populations of T-cells in various tissues, among which Tregs in Non-Lymphoid tissues. From these datasets we identified shared peaks within the human and murine datasets; open chromatin that was conserved between species. We examined BATF binding in this shared peakset and found that more than half of the shared peaks had a BATF binding site, indicating importance in both human and murine tissue Tregs. Upon closer look we found that BATF gene activity score was increased in tissue Tregs compared to blood derived Tregs. Using bulk ATAC sequencing to identify changes in chromatin accessibility, we were able to show that we could induce a tissue Treg-like profile with the combination of cytokines IL-4 and IL-33 in mouse, and that this induction is depended on the Batf, confirming that Batf is both essential in-vitro and in-vivo. Among the shared peakset, we could identify several surface receptors, among which CCR8. Upon closer look we could determine that CCR8 gene activity was increased in both blood memory Tregs and tissue derived Tregs. This could be confirmed on protein level in blood and in tissues, where we could identify a subpopulation of CCR8+ Tregs in memory Tregs in the blood. In fat and skin, the vast majority of Tregs was CCR8+. We also found that CCR8+ Tregs express a significantly higher amount of FOXP3, BATF and CD25, on both RNA and protein levels. Next we worked to identify more surface markers using LEGENDScreen™. We identified HLA-DR as a reliable positive selection marker for CCR8+ Tregs in blood, fat and skin. CD49d could be identified as a negative selection marker for these same cells. Using single cell RNA sequencing (scRNA-seq) and Single cell TCR sequencing (scTCR-seq) we were able to identify a clonal relationship between CCR8+ from blood, fat and skin, indicating that circulating CCR8+ Tregs are either potential progenitors or recirculating tissue Tregs. Through published datasets and our own RNA-seq data, we were able to show that human tissue Tregs have a Tfh-like phenotype, unlike murine tissue Tregs, which have a Th2-like phenotype. This phenotype could be induced with the cytokines IL-2, TGFβ, IL-12, IL-21, and IL-23. Supernatant produced by cells cultured with these cytokines were superior at woundhealing compared to IL-2 only Tregs. Finally, we were able to show that Tregs found in tumours share many commonalities with Tregs found in healthy tissue, like BATF, CCR8 and HLA-DR expression.
Translation of the abstract (German)
Regulatorische T-Zellen (Tregs) zeichnen sich durch die Expression von FOXP3 aus und sind wichtig für die Regulierung anderer zellulärer Komponenten des Immunsystems. Ihr Fehlen führt zu Autoimmunerkrankungen wie dem "Scurfy-Phänotyp" bei Mäusen oder dem Immunodysregulation, Polyendocrinopathy, Enteropathy, X-linked (IPEX) Syndrom beim Menschen. Tregs aus nicht-lymphoidem Gewebe (NLT) ...
Translation of the abstract (German)
Regulatorische T-Zellen (Tregs) zeichnen sich durch die Expression von FOXP3 aus und sind wichtig für die Regulierung anderer zellulärer Komponenten des Immunsystems. Ihr Fehlen führt zu Autoimmunerkrankungen wie dem "Scurfy-Phänotyp" bei Mäusen oder dem Immunodysregulation, Polyendocrinopathy, Enteropathy, X-linked (IPEX) Syndrom beim Menschen. Tregs aus nicht-lymphoidem Gewebe (NLT) unterscheiden sich von Tregs aus lymphatischem Gewebe (LT). Durch den Vergleich des Genexpressionsprofils (Transkriptom) und des DNA-Methylierungsprofils (Epigenom) von NLT- und LT-Treg-Zellen in Mäusen identifizierte unser Labor Transkriptionsfaktoren und andere Gene, die in NLT-Tregs besonders angereichert sind. Dies führte zur Identifizierung einer gewebespezifischen Treg-Untergruppe in Mäusen, die sich durch die Oberflächenexpression von Klrg1 und ST2, ein TH2-betontes Genprogramm sowie die Produktion von Amphiregulin auszeichnet, das nachweislich die Gewebereparatur unterstützt. In der Maus wird dieses Programm durch den Transkriptionsfaktor Batf gesteuert.
In dieser Arbeit haben wir versucht, das menschliche Gegenstück dieser Population zu identifizieren. Wir haben Methoden zur Isolierung von T-Zellen aus Geweben entwickelt, und als dies optimiert war, haben wir den Assay for Transposase Accessible Chromatin following Sequencing (ATAC-seq) auf Einzelzellebene (scATAC-seq) durchgeführt, um Veränderungen der Chromatinzugänglichkeit von CD4+ T-Zellen bei Mäusen und Menschen zu ermitteln. Wir haben festgestellt, dass dies eine gute und zuverlässige Methode ist, um verschiedene Populationen von T-Zellen in verschiedenen Geweben zu identifizieren, darunter auch Tregs in nicht-lymphoiden Geweben. Anhand dieser Datensätze identifizierten wir gemeinsame Peaks in den Datensätzen von Mensch und Maus; offenes Chromatin, das zwischen den Spezies konserviert war. Wir untersuchten die BATF-Bindung in diesem gemeinsamen Peaksatz und stellten fest, dass mehr als die Hälfte der gemeinsamen Peaks eine BATF-Bindungsstelle aufwiesen, was auf eine wichtige Rolle sowohl bei Tregs in menschlichem als auch in murinem Gewebe hinweist. Bei näherer Betrachtung stellten wir fest, dass der BATF-Genaktivitätswert bei Gewebe-Tregs im Vergleich zu Tregs aus Blut erhöht war. Mit Hilfe der ATAC-Sequenzierung zur Identifizierung von Veränderungen in der Chromatinzugänglichkeit konnten wir zeigen, dass wir mit der Kombination der Zytokine IL-4 und IL-33 in der Maus ein Treg-ähnliches Profil im Gewebe induzieren können und dass diese Induktion von Batf abhängt, was bestätigt, dass Batf sowohl in vitro als auch in vivo wichtig ist. Unter dem gemeinsamen Peakset konnten wir mehrere Oberflächenrezeptoren identifizieren, darunter CCR8. Bei näherer Betrachtung konnten wir feststellen, dass die Genaktivität von CCR8 sowohl bei Tregs aus dem Blutgedächtnis als auch bei Tregs aus dem Gewebe erhöht war. Dies konnte auf Proteinebene im Blut und in Geweben bestätigt werden, wo wir eine Subpopulation von CCR8+ Tregs in den Memory-Tregs im Blut identifizieren konnten. In Fett und Haut war die große Mehrheit der Tregs CCR8+. Wir fanden auch heraus, dass CCR8+ Tregs eine signifikant höhere Menge an FOXP3, BATF und CD25 exprimieren, sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene. Als Nächstes arbeiteten wir daran, mit LEGENDScreen™ weitere Oberflächenmarker zu identifizieren. Wir identifizierten HLA-DR als einen zuverlässigen positiven Selektionsmarker für CCR8+ Tregs in Blut, Fett und Haut. CD49d konnte als negativer Selektionsmarker für dieselben Zellen identifiziert werden. Mit Hilfe der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) und der Einzelzell-TCR-Sequenzierung (scTCR-seq) konnten wir eine klonale Beziehung zwischen CCR8+ aus Blut, Fett und Haut feststellen, was darauf hindeutet, dass zirkulierende CCR8+ Tregs entweder potenzielle Vorläuferzellen oder rezirkulierende Gewebe-Tregs sind. Anhand veröffentlichter Datensätze und unserer eigenen RNA-seq-Daten konnten wir zeigen, dass menschliche Gewebe-Tregs einen Tfh-ähnlichen Phänotyp aufweisen, im Gegensatz zu Gewebe-Tregs aus der Maus, die einen Th2-ähnlichen Phänotyp haben. Dieser Phänotyp konnte durch die Zytokine IL-2, TGFβ, IL-12, IL-21 und IL-23 induziert werden. Der Überstand von Zellen, die mit diesen Zytokinen kultiviert wurden, war bei der Wundheilung im Vergleich zu Tregs, die nur IL-2 erhielten, überlegen. Schließlich konnten wir zeigen, dass Tregs, die in Tumoren gefunden werden, viele Gemeinsamkeiten mit Tregs in gesundem Gewebe haben, wie z. B. die Expression von BATF, CCR8 und HLA-DR.
Metadata last modified: 24 Nov 2021 10:12
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