| License: Publishing license for publications excluding print on demand (11MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-519055
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.51905
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 4 March 2022 |
| Referee: | Prof. Dr. Denitsa Docheva |
| Date of exam: | 15 February 2022 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Unfallchirurgie |
| Keywords: | dental follicle cells, scaffoldfree approach, ligamentogenic differentiation, tissue engineering |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 51905 |
Abstract (English)
Introduction: Human periodontal ligament (PDL) is a specialized loose connective tissue that is believed to arise from a dental follicle. It is composed of parallel collagen fibres binding the tooth root to the alveolar bone, and constituting the tooth-supporting structure . Periodontitis is caused mainly by infections and/or inflammation of the gums and progressively destroys the ...
Abstract (English)
Introduction: Human periodontal ligament (PDL) is a specialized loose connective tissue that is believed to arise from a dental follicle. It is composed of parallel collagen fibres binding the tooth root to the alveolar bone, and constituting the tooth-supporting structure . Periodontitis is caused mainly by infections and/or inflammation of the gums and progressively destroys the tooth-supporting structure until tooth loss occurs. Epidemiological studies suggest that over 50% of worldwide adult population suffers from periodontitis. Therefore, investigating effective and safe therapies to repair or regenerate PDL is critical for the oral health.
Currently, ideal conservative therapies in use, such as scaling and root planning, prevent progression of periodontitis by physically removing pathogens and necrotic tissue. However, PDL can only be partially regenerated at the treated sites and clinical outcomes frequently remain unsatisfactory. Tissue engineering-based therapies serve to replace the impacted PDL with an engineered PDL-like tissue. Classical tissue engineering combines growth factors, biomaterial scaffolds and cells to produce a three-dimensional (3D) tissue mimetic. Recently, self-assembly organoid models such as pellet and cell sheet cultures have gained a lot of interest, because they parallel the natural tissue formation process and facilitate native cell-to-cell and cell-to-matrix interactions, which initiate appropriate and inherent cell signaling cascades of the cell types used (Yan et al., 2018). Several studies report that self-assembly model holds a great potential for tissue engineering therapy.
Dental follicle cells (DFCs) are cells extracted from the dental follicle. The dental follicle surrounds the developing tooth, is present until tooth eruption, and contains various progenitor cells which are derived from condensed mesenchyme. DFCs have been shown to express mesenchymal stem cell markers, such as CD90 and CD105, but not hematopoietic markers. Several in vitro and in vivo models have suggested a promising PDL differentation protential of DFCs. Thus,the objective of my thesis was to investigate the PDL tissue-forming ability of DFCs using a novel self-assembly 3D organoid model for ligamentogenesis and by carrying out detailed histomorphometric, quantitative polymerase chain reaction (PCR) and protein analyses.
Materials & Methods: Commercial DFCs (n=6) were purchased from AllCells (Alameda, California, USA). Cells were extracted from impacted wisdom teeth of young (18-25 years old) healthy individuals and were validated and characterized by flow cytometry analyses (FACS) and triple-lineage differentiation assay. The PDL-hTERT immortal cell line was established and characterized previously. DFCs and PDL-hTERT were plated in cell culture dishes and our three-step differentiation protocol was employed. Both cell types were subjected to organoid formation and maturation for a total duration of 5 weeks. Afterward, the matured organoids were cross evaluated using wet weight analysis, hematoxylin & eosin (H&E) staining, quantitative analysis of cell row structure, nuclear angular deviation and cell density, quantitative PCR, cytohistochemistry, and density metric analysis of collagen 1 (COL 1) and collagen 3 (COL 3).
Results: Evaluation of gene expression of two-dimensionally (2D) cultured DFCs and PDL-hTERT cells revealed differential expression of 9 different ligament-related genes and 2 multipotency-related genes in DFCs. Organoid wet weight analysis revealed comparable weight between both organoid types on the 14th day of the maturation stage. H&E staining and histomorphometry of DFCs and PDL-hTERT 3D organoids suggested obvious and significant morphology differences. Briefly, DFCs had well-aligned mono-string cell rows in structure, whereas PDL-hTERT exhibited clustered morphology and multi-string cell row structures. The nucleus-axis angular deviation in PDL-hTERT organoids was significantly higher than that observed in DFC organoids. Further investigation by cytohistochemistry indicated greater COL 3 deposition in DFC organoids and higher COL 1 deposition in PDL-hTERT organoids. However, the gene expression profiling of DFC organoids largely overlapped with that of PDL-hTERT organoids. Only 7 different genes showed a significant difference between the 2 groups.
Conslusion: This doctoral thesis using the 3D scaffold-free organoid model demonstrated that DFCs differentiate towards PDL-like tissue mimetic. Moreover, DFCs exhibited superior organoid morphology, cell row organization and angular deviation, as well as higher levels of several ligament-related genes compared to the PDL-hTERT cell line. Thus, the 3D organoid model could serve as a novel strategy to direct DFC behavior, which could be further developed for functional PDL engineering application.
Translation of the abstract (German)
Einleitung: Als humanes periodontales Ligament (PDL) wird ein spezialisiertes, loses Bindegewebe beschrieben, von welchem man annimmt, dass es aus dem Zahnfollikel entsteht. Dieses Gewebe setzt sich aus parallelen Kollagenfasern zusammen, welche die Zahnwurzel mit dem Alveolarknochen verbinden und die den Zahn stützende Struktur bilden. Parodontitis wird hauptsächlich durch Infektionen und/oder ...
Translation of the abstract (German)
Einleitung: Als humanes periodontales Ligament (PDL) wird ein spezialisiertes, loses Bindegewebe beschrieben, von welchem man annimmt, dass es aus dem Zahnfollikel entsteht. Dieses Gewebe setzt sich aus parallelen Kollagenfasern zusammen, welche die Zahnwurzel mit dem Alveolarknochen verbinden und die den Zahn stützende Struktur bilden. Parodontitis wird hauptsächlich durch Infektionen und/oder Entzündungen des Zahnfleisches verursacht und zerstört nach und nach die zahntragende Struktur, was zum Zahnverlust führen kann. Epidemiologische Studien deuten darauf hin, dass über 50% der erwachsenen Bevölkerung weltweit an Parodontitis leiden. Aus diesem Grund ist die Erforschung von wirksamen und sicheren Therapien zur Reparatur oder Regeneration des PDL entscheidend für die Mundgesundheit.
Die derzeit angewandten konservativen Therapien der Wurzelbehandlung verhindern das Fortschreiten der Parodontitis durch die Entfernung von Pathogenen und nekrotischem Gewebe. Allerdings kann das PDL an den behandelten Stellen so nur teilweise regeneriert werden und die klinischen Ergebnisse bleiben häufig unbefriedigend. Tissue Engineering-basierte Therapien dienen dazu, das geschädigte PDL durch ein PDL-ähnliches Gewebe zu ersetzen. Beim klassischen Tissue Engineering werden Wachstumsfaktoren, Biomaterialgerüste und Zellen kombiniert, um ein dreidimensionales (3D) Gewebemimetikum herzustellen. Seit kurzem wecken Selbstassemblierungsmodelle für Organoide wie Pellet- und „Cellsheet“-Kulturen großes Interesse, da sie einerseits dem natürlichen Gewebebildungsprozess entsprechen und andererseits native Zell-zu-Zell- und Zell-zu-Matrix-Interaktionen ermöglichen, welche geeignete und inhärente Zellsignalkaskaden der verwendeten Zelltypen initiieren. Diverse Studien berichten, dass das Modell der Selbstorganisation ein großes Potenzial für Tissue Engineering Therapien birgt.
Zahnfollikelzellen (DFCs) sind Zellen, die aus dem Zahnfollikel gewonnen werden. Der Dentalfollikel umgibt den sich entwickelnden Zahn, bleibt bis zum Zahndurchbruch bestehen und enthält verschiedene Vorläuferzellen, die aus dem Mesenchym stammen. DFCs exprimieren mesenchymale Stammzellmarker wie CD90 und CD105, jedoch keine hämatopoetischen Marker. In mehreren in-vitro- und in-vivo-Modellen wurde bereits ein vielversprechendes PDL-Differenzierungsprotokoll von DFCs etabliert. Das Ziel meiner Dissertation war es, die Fähigkeit von DFCs, PDL-ähnliches Gewebe zu bilden, mit Hilfe eines neuartigen 3D-Organoidmodells für die Ligamentogenese und durch detaillierte histomorphometrische Analysen, quantitativen Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) und Proteinanalysen zu untersuchen.
Material und Methoden: Die DFCs (n=6) wurden von AllCells (Alameda, Kalifornien, USA) erworben. Die Zellen wurden aus den Weisheitszähnen junger (18-25 Jahre), gesunder Personen extrahiert und durch durchflusszytometrische Analysen (FACS) sowie einen Triple-Lineage-Differenzierungsassay validiert und charakterisiert. Die PDL-hTERT-Zelllinie wurde bereits zuvor etabliert und charakterisiert. DFCs und PDL-hTERT-Zellen wurden in Zellkulturschalen ausplattiert, woraufhin unser dreistufiges Differenzierungsprotokoll angewendet wurde. Beide Zelltypen wurden über einen Zeitraum von insgesamt fünf Wochen der Organoidbildung und -reifung unterzogen. Die ausgereiften Organoide wurden anschließend mittels Feuchtgewichtsanalyse, Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E), quantitativer Analyse der Zellreihenstruktur, Kernwinkelabweichung und Zelldichte, quantitativer PCR, Zytohistochemie und Dichteanalyse von Kollagen 1 (COL 1) und Kollagen 3 (COL 3) bewertet.
Ergebnisse: Die Auswertung der Genexpression von zweidimensional (2D) kultivierten DFCs und PDL-hTERT-Zellen zeigte eine unterschiedliche Expression von 9 verschiedenen ligamentbezogenen Genen und 2 multipotenzbezogenen Genen in den DFCs. Die Analyse des Feuchtgewichts der Organoide ergab, dass beide Organoidtypen am 14. Tag der Reifung ein vergleichbares Gewicht aufwiesen. Die H&E-Färbung und die histomorphometrische Analyse von DFCs und PDL-hTERT 3D-Organoiden zeigten deutliche und signifikante morphologische Unterschiede. Die DFCs hatten eine gut ausgerichtete Struktur mit einsträngigen Zellreihen, während die PDL-hTERT-Zellen eine gebündelte Morphologie und mehrsträngige Zellreihenstrukturen aufwiesen. Die Winkelabweichung der Kernachsen war in PDL-hTERT-Organoiden signifikant höher als die der DFC-Organoiden. Weitere zytohistochemische Untersuchungen zeigten eine stärkere Ablagerung von COL 3 in DFC-Organoiden und eine stärkere Ablagerung von COL 1 in PDL-hTERT-Organoiden. Das Genexpressionsprofil der DFC-Organoide stimmte jedoch weitgehend mit dem der PDL-hTERT-Organoide überein. Nur 7 verschiedene Gene zeigten einen signifikanten Unterschied zwischen den zwei Gruppen.
Schlussfolgerung: In dieser Doktorarbeit wurde mit Hilfe des gerüstfreien 3D-Organoidmodells gezeigt, dass DFCs in ein PDL-ähnliches Gewebemimetikum ausdifferenzieren können. Darüber hinaus wiesen DFCs im Vergleich zur PDL-hTERT-Zelllinie eine bessere Organoid-Morphologie, Zellreihenorganisation und Winkelabweichung sowie eine höhere Konzentration verschiedener ligamentbezogener Gene auf. Dieses 3D-Organoidmodell könnte somit eine neue Strategie zur Steuerung des Verhaltens von DFCs sein, welches zudem für den Gebrauch im funktionellen PDL-Engineering weiterentwickelt werden könnte.
Metadata last modified: 14 Mar 2022 20:15
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