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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-519426
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 22 March 2022 |
| Referee: | Prof. Dr. Bernhard Weber |
| Date of exam: | 10 March 2022 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Humangenetik |
| Keywords: | AMD, Neurturin, NRTN |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 51942 |
Abstract (German)
Die AMD ist eine degenerative Erkrankung der Netzhaut und geht mit einem Absterben von RPE Zellen und Photorezeptoren, speziell in der zentralen Region der Netzhaut, der Makula, einher (zusammengefasst in Ding et al. 2009). Als führende Ursache für irreversible Sehschäden bei Menschen über 60 Jahren in der westlichen Welt (zusammengefasst in Wong et al. 2014), ist die AMD eine weit verbreitete ...
Abstract (German)
Die AMD ist eine degenerative Erkrankung der Netzhaut und geht mit einem Absterben von RPE Zellen und Photorezeptoren, speziell in der zentralen Region der Netzhaut, der Makula, einher (zusammengefasst in Ding et al. 2009). Als führende Ursache für irreversible Sehschäden bei Menschen über 60 Jahren in der westlichen Welt (zusammengefasst in Wong et al. 2014), ist die AMD eine weit verbreitete multifaktorielle Erkrankung, welche mit hohem Leidensdruck bei den Erkrankten verbunden ist. Mehrere Faktoren tragen zur Entstehung der Erkrankung bei. Dazu gehört neben Alter, Rauchen, Ethnizität und weiteren Umweltfaktoren auch und zu einem großen Anteil die genetische Disposition. Varianten im CFH Gen und im ARMS2/HTRA1 Locus machen dabei den Großteil des genetischen Risikos aus (zusammengefasst in DeAngelis et al. 2017). Nachdem die AMD unbehandelt zur Erblindung führt und lediglich für die CNV, die „feuchte“ Spätform der AMD, mit der anti-VEGF Therapie eine Möglichkeit zur Behandlung existiert, besteht die Hoffnung, dass die zunehmende Aufklärung der molekularen Pathogenese der AMD, insbesondere der geographischen Atrophie, zu weiteren therapeutischen Ansätzen führt.
In einer Genom-weiten Assoziationsstudie im Jahr 2016 wurden von Fritsche und Kollegen 18 bekannte und 16 neue AMD-assoziierte Genloci mit Genom-weiter Signifikanz beschrieben (Fritsche et al. 2016). Für dieses Projekt sollte der AMD-assoziierte Polymorphismus rs79744308:G>A im NRTN-Gen bezüglich seines Effekts auf die NRTN Proteinfunktion analysiert werden, um so einen möglichen Einfluss von NRTN auf die AMD-Pathogenese zu untersuchen.
Bindeversuche der nicht protektiven (rs79744308:G) und der protektiven (rs79744308:A) NRTN Varianten an den Zelllinien ARPE-19, BV2, Hek293 EBNA, hiPSC-RPE, HUVEC, Weri-Rb1 und Y-79, welche auch in anschließenden funktionellen Versuchen eingesetzt wurden, zeigten die Bindung von NRTN an diese Zelllinien, jedoch keinen Effekt von rs79744308 auf die Bindungsaffinität. Im nächsten Schritt wurden dann Ansätze etabliert, welche als Grundlage für Versuche zum Effekt von NRTN auf AMD-assoziierte zelluläre Prozesse dienten. Die Aufreinigung rekombinant hergestellten NRTNs misslang trotz mehrerer Modifikationen des Versuchsprotokolls, vermutlich aufgrund der Bindung von NRTN an das Säulenmaterial. Daraufhin wurden weitere Ansätze entwickelt, welche eine Untersuchung von AMD-assoziierten Prozessen an Zellen ermöglichten, die auf NRTN-haltiger EZM kultiviert worden waren. Des Weiteren wurden bicistronische Expressionsvektoren kloniert, welche die gleichzeitige heterologe Expression von GFP als Transfektionsmarker und NRTN ermöglichten. Durch diese Vektoren können funktionelle Analysen an Zellen durchgeführt werden, die heterolog NRTN der AMD-protektiven oder nicht protektiven assoziierten Variante exprimieren. Hierfür wurden zusätzlich verschiedene Transfektionsstrategien für retinale Zelllinien ausgetestet.
In ersten funktionellen Versuchen wurde ein Effekt von NRTN auf den ERK Signalweg und die neuronale Differenzierung von Weri-Rb1 Zellen gezeigt. Untersuchungen zur Autophagie wiesen eine erfolgreiche Autophagie-Induktion in Weri-Rb1 nach, während dies bei ARPE-19 und hiPSC-RPE Zellen misslang. In Expressionsstudien wurde die Veränderung spezifischer Transkripte in Weri-Rb1 und hiPSC-RPE Zellen, welche eine Rolle in der AMD-Pathogenese spielen, auf oxidativen Stress hin untersucht. Die ersten Ergebnisse lassen bereits auf Effekte von NRTN bei der Expression bestimmter Gene, wie zum Beispiel cFOS schließen. Weitere Replikationen und eventuelle Modifikationen der Versuchsprotokolle (z.B. für Autophagie-Induktion in RPE-Zelllinien) müssen durchgeführt werden, um die beobachteten Effekte zu verifizieren und mit der nötigen statistischen Aussagekraft zu versehen.
Translation of the abstract (English)
AMD is a degenerative disease of the retina and is accompanied by a loss of RPE cells and photoreceptors in the central region of the retina, the macula (summarized by Ding et al. 2009). As the leading cause for irreversible blindness in people over 60 years of age in western societies (summarized in Wong et al. 2014), AMD ist a wide-spread disease causing great suffering for affected ...
Translation of the abstract (English)
AMD is a degenerative disease of the retina and is accompanied by a loss of RPE cells and photoreceptors in the central region of the retina, the macula (summarized by Ding et al. 2009). As the leading cause for irreversible blindness in people over 60 years of age in western societies (summarized in Wong et al. 2014), AMD ist a wide-spread disease causing great suffering for affected individuals. Many risk factors contribute to its development. These include age, smoking, ethnicity and other environmental factors as well as genetic disposition. Variants in the CFH gene and in the ARMS2/HTRA1 locus account for the largest part of the genetic risk (summarized in DeAngelis et al. 2017). As AMD leads to irreversible blindness if left untreated, and as there is only a therapeutic possibility for CNV, the „wet“ late stage AMD, there is hope that further clarification of the AMD pathogenesis will lead to new therapeutical approaches, specifically for the “dry” atrophic form of the disease.
In a large genome-wide association study, Fritsche and colleagues identified 18 known and 16 new AMD associated gene loci with genom-wide significance (Fritsche et al. 2016). In the present thesis, the AMD associated polymorphism rs79744308:G>A in the NRTN gene was analysed for its effects on NRTN protein function, in order to investigate a putative involvement of NRTN in AMD pathogenesis.
Binding assays of the non protective and protective NRTN variants to the cell lines ARPE-19, BV2, Hek293 EBNA, hiPSC-RPE, HUVEC, Weri-Rb1 and Y-79, which were also used for further functional investigations, showed binding of NRTN to these cell lines, although there was no effect of rs79744308 on binding affinity. In the next step, model systems were established as a basis for further investigations of NRTN effects on AMD associated cellular processes. The purification of recombinantly produced NRTNs failed despite different modifications of the initial purification protocol, presumably due to binding of NRTN to the column material. Consequently further approaches were developed enabling an investigation of cells which had been cultivated on NRTN-containing ECM. Furthermore bicistronic expression vectors were cloned facilitating simultaneous heterologous expression of GFP as a transfection marker and the NRTN propeptide. These vectors now allow functional analyses on cells which heterologously express NRTN of the AMD non protective or protective variant. In connection therewith, different transfection conditions were tested for retinal cell lines.
First results from the functional assays revealed an effect of NRTN on the ERK signaling pathway, but also an effect on neuronal differentiation of Weri-Rb1 cells. Experiments adressing autophagy showed a successful autophagy induction in Weri-Rb1 cells, but not in ARPE-19 or hiPSC-RPE cells. After oxidative stress treatment the expression of specific target genes that play a role in AMD pathogenesis was investigated in qRT-PCR experiments in Weri-Rb1 and hiPSC-RPE cells. First results indicate an effect of NRTN on the expression of distinct genes, like cFOS. Nevertheless additional replications and modifications of the assay protocols (e.g. for autophagy induction in RPE cell lines) need to be performed to verify observed effects and provide appropriate statistical significance.
Metadata last modified: 22 Mar 2022 12:03
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