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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-527294
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.52729
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 9 August 2022 |
| Referee: | Prof. Dr. Bernhard H. F. Weber |
| Date of exam: | 15 July 2022 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Humangenetik |
| Keywords: | Na/K-ATPase, Retinoschisin, X-linked juvenile Retinoschisis |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 52729 |
Abstract (English)
Pathologic mutations in the RS1 gene on Xp 22.13 cause X-linked juvenile retinoschisis (XLRS) (Sauer et al. 1997), a hereditary retinal dystrophy manifesting in juvenile or adolescent males (Pagenstecher et al. 1913). A hallmark of XLRS is the splitting of the inner retinal layers (schisis) and defects in signal transmission of photoreceptor to bipolar cells (Khan et al. 2001). The RS1 gene ...
Abstract (English)
Pathologic mutations in the RS1 gene on Xp 22.13 cause X-linked juvenile retinoschisis (XLRS) (Sauer et al. 1997), a hereditary retinal dystrophy manifesting in juvenile or adolescent males (Pagenstecher et al. 1913). A hallmark of XLRS is the splitting of the inner retinal layers (schisis) and defects in signal transmission of photoreceptor to bipolar cells (Khan et al. 2001). The RS1 gene encodes the retina-specific protein retinoschisin known to directly interact with the ATP1B2 subunit of the retinal Na/K-ATPase at photoreceptor inner segments (Molday et al. 2007; Plössl et al. 2017a). The retinal Na/K-ATPase, consisting of the two subunits ATP1A3 and ATP1B2, was shown to anchor retinoschisin at the plasma membrane of photoreceptors (Friedrich et al. 2011). This work aimed to analyze structural and functional features of the retinoschisin-Na/K-ATPase complex to provide further insights into the initial steps in XLRS pathology.
The first project addressed the question of the ATP1B2-retinoschisin interphase as well as the diffusion of the complex in the membrane. Testing retinoschisin binding to deglycosylated retinal Na/K-ATPase, under the presence of different sugars, or to mutant ATP1B2, the binding of retinoschisin to the retinal Na/K-ATPase was shown to be attenuated by high sugar concentrations but nevertheless independent of ATP1B2-attached glycoside chains. Instead, retinoschisin binding was shown to be achieved by direct interaction with the ATP1B2 subunit. In specific, the presence of a polar residue at amino acid 240 was determined to play a key role in the interaction with retinoschisin. Fluorescence correlation spectroscopy analyses using Hek293 cells heterologously expressing the retinal Na/K-ATPase subunits ATP1A3 and ATP1B2 revealed no effect of retinoschisin on the lateral diffusion of the Na/K-ATPase.
In a second project, the interplay of retinoschisin and cardiac glycosides, which bind to the ATP1A3 subunit of the Na/K-ATPase, was investigated. Retinoschisin binding assays revealed a displacement of retinoschisin from the retinal Na/K-ATPase by both cardiac glycosides ouabain and digoxin. Enzymatic assays, which quantified cardiac glycoside-sensitive Na/K-ATPase pump activity, and analyses measuring retinoschisin-dependent binding of tritium-labeled ouabain to the Na/K-ATPase showed no effect of retinoschisin on the binding of cardiac glycosides to the retinal Na/K-ATPase. Immunolabeling of retinal explants of retinoschisin-deficient mice incubated with recombinant retinoschisin or cardiac glycosides showed that the presence of cardiac glycosides disturbed the capacity of retinoschisin to protect against photoreceptor degeneration.
The third project of the thesis aimed to identify possible additional interaction partners of the retinoschisin-Na/K-ATPase complex. Western blot analyses of a co-immunoprecipitation of porcine retinal lysates with ATP1A3 showed that none of the known interaction partners of other α-subunits of Na/K-ATPases (e.g., SRC, RAS, PI3K, NCX, and PLC for ATP1A1) binds to the retinal Na/K-ATPase. Immunolabeling of retinoschisin-deficient murine retinae showed mislocalization from the literature known retinal Na/K-ATPase interaction partner AnkB starting at postnatal day (P)18 similar to the mislocalization of the retinal Na/K-ATPase. An undirected approach using mass spectrometric analysis of ATP1A3 co-immunoprecipitation products from porcine retinal lysates identified more than 200 possible interaction partners of retinal Na/K-ATPase. Three candidates, ANXA2, and both Kv channel subunits Kv2.1 and Kv8.2, were subjected to further analyses. While co-immunoprecipitation from murine retinal lysates did not corroborate a direct interaction of the retinal Na/K-ATPase with AnxA2, the interaction with Kv2.1 and Kv8.2 was confirmed. In immunolabeling of retinal cryosections, an increasing mislocalization of AnxA2, Kv2.1 and Kv8.2 was detected during postnatal development of the retinoschisin-deficient mouse retina. Notably, Kv2.1 showed maldistribution already at P7, while an incorrect localization for AnxA2, similar to AnkB and the retinal Na/K-ATPase, emerged at P18, after schisis and photoreceptor apoptosis. In further investigations of Kv2.1 and Kv8.2 in retinoschisin-deficient mice, a reduction in their protein levels, also before P14, in specific at P10, was demonstrated via western blot analysis, while in each case no effect on gene expression was observed. Finally, Kv channel activity was measured with Y-79 cells. Patch-clamp analyses and live-cell calcium imaging revealed no effect of retinoschisin on the Kv channel mediated potassium ion current or calcium homeostasis.
Taken together, the performed experimental work provides new insights into the functional and structural composition of the retinoschisin Na/K-ATPase complex and suggests the formation of a macromolecular complex in photoreceptor inner segments with other proteins like the channel subunits like Kv2.1 and Kv8.2. These findings provide new insights into the initial pathological processes of XLRS and could thus promote the development of new therapeutic options for this currently untreatable disease.
Translation of the abstract (German)
Pathologische Mutationen im RS1-Gen auf Xp 22.13 verursachen die X-chromosomale juvenile Retinoschisis (XLRS) (Sauer et al. 1997), eine erbliche Netzhautdystrophie, die bei jugendlichen oder heranwachsenden Männern auftritt (Pagenstecher et al. 1913). Ein Kennzeichen von XLRS ist die Spaltung der inneren Netzhautschichten (Schisis) und Defekte in der Signalweiterleitung von den Photorezeptoren zu ...
Translation of the abstract (German)
Pathologische Mutationen im RS1-Gen auf Xp 22.13 verursachen die X-chromosomale juvenile Retinoschisis (XLRS) (Sauer et al. 1997), eine erbliche Netzhautdystrophie, die bei jugendlichen oder heranwachsenden Männern auftritt (Pagenstecher et al. 1913). Ein Kennzeichen von XLRS ist die Spaltung der inneren Netzhautschichten (Schisis) und Defekte in der Signalweiterleitung von den Photorezeptoren zu den Bipolarzellen (Khan et al. 2001). Das RS1-Gen kodiert für das retina-spezifische Protein Retinoschisin, welches direkt mit der ATP1B2-Untereinheit der retinalen Na/K-ATPase in den inneren Segmenten der Photorezeptoren interagiert (Molday et al. 2007; Plössl et al. 2017a). Die retinale Na/K-ATPase, bestehend aus den beiden Untereinheiten ATP1A3 und ATP1B2, verankert Retinoschisin an der Plasmamembran von Photorezeptoren (Friedrich et al. 2011). Ziel dieser Arbeit war es, die strukturellen und funktionellen Merkmale des Retinoschisin-Na/K-ATPase-Komplexes zu analysieren, um so einen Beitrag zur weiteren Aufklärung der initialen Ereignisse der XLRS-Pathologie zu leisten.
Das erste Projekt befasste sich mit der Fragestellung zur ATP1B2-Retinoschisin Interaktionsfläche sowie zur Diffusion des Komplexes innerhalb der Plasmamembran. Bei der Analyse der Bindung von Retinoschisin an die deglykosylierte retinale Na/K-ATPase in Gegenwart verschiedener Zucker oder an mutiertes ATP1B2 zeigte sich, dass die Bindung von Retinoschisin an die retinale Na/K-ATPase durch hohe Zuckerkonzentrationen abgeschwächt wird, aber dennoch unabhängig von ATP1B2-gebundenen Zuckerketten erfolgt. Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass Retinoschisin direkt mit der ATP1B2-Untereinheit interagiert. Zudem wurde festgestellt, dass die Anwesenheit eines polaren Restes an der Aminosäure 240 eine Schlüsselrolle bei der Interaktion mit Retinoschisin spielt. Fluoreszenz-Korrelation spektrometrische Analysen an Hek293 Zellen, die die retinalen Na/K-ATPase-Untereinheiten ATP1A3 und ATP1B2 heterolog exprimieren, zeigten keinen Effekt von Retinoschisin auf die laterale Diffusion der Na/K-ATPase.
In einem zweiten Projekt wurde das Zusammenspiel von Retinoschisin und Herzglykosiden, die an die ATP1A3-Untereinheit der Na/K-ATPase binden, untersucht. Retinoschisin-Bindungsversuche zeigten eine Verdrängung von Retinoschisin gegenüber der retinalen Na/K-ATPase durch die beiden Herzglykoside Ouabain und Digoxin. Enzymatische Assays zur Quantifizierung der Herzglykosid-sensitiven Na/K-ATPase Pumpaktivität sowie Analysen zur Messung der Retinoschisin-abhängigen Bindung von Tritium-markiertem Ouabain an die Na/K-ATPase zeigten keinen Einfluss von Retinoschisin auf die Bindung von Herzglykosiden an die retinale Na/K-ATPase. Die immunhistochemische Färbung von Netzhautexplantaten Retinoschisin-defizienter Mäuse, die mit rekombinantem Retinoschisin oder Herzglykosiden behandelt wurden, zeigte, dass bei Anwesenheit von Herzglykosiden die Fähigkeit von Retinoschisin, vor der Degeneration der Photorezeptoren zu schützen, beeinträchtigt ist.
Ziel des dritten Projektes der Dissertation war es, etwaige weitere Interaktionspartner des Retinoschisin-Na/K-ATPase-Komplexes zu identifizieren. Western Blot Analysen einer Ko-Immunpräzipitation von Schweineretina-Lysaten mit ATP1A3 zeigten, dass keiner der bekannten Interaktionspartner anderer α-Untereinheiten der Na/K-ATPasen (z.B. SRC, RAS, PI3K, NCX und PLC für ATP1A1) an die retinale Na/K-ATPase bindet. Die immun-histochemische Färbung von Retinoschisin-defizienten Mäusen zeigte eine Fehllokalisierung des aus der Literatur bekannten retinalen Na/K-ATPase-Interaktionspartners AnkB ab dem postnatalen Tag (P) 18, ähnlich zur Fehllokalisierung der retinalen Na/K-ATPase. Ein ungerichteter Ansatz, bei dem eine massenspektrometrische Analyse der ATP1A3 Ko-Immunpräzipitationsprodukte aus Schweineretina-Lysaten durchgeführt wurde, identifizierte mehr als 200 mögliche Interaktionspartner der retinalen Na/K-ATPase. Drei Kandidaten, ANXA2 und die beiden Kv-Kanal Untereinheiten Kv2.1 und Kv8.2, wurden weiteren Untersuchungen unterzogen. Während eine Ko-Immunpräzipitation aus murinen Netzhaut-Lysaten eine direkte Interaktion der retinalen Na/K-ATPase mit AnxA2 nicht bestätigte, wurde die Interaktion mit Kv2.1 und Kv8.2 bestätigt. Bei der immunhistochemischen Färbung von retinalen Kryoschnitten wurde eine zunehmende Fehllokalisierung von AnxA2, Kv2.1 und Kv8.2 während der postnatalen Entwicklung der Retinoschisin-defizienten Mausretina festgestellt. Insbesondere Kv2.1 zeigte bereits bei P7 eine Fehlverteilung, während eine fehlerhafte Lokalisation für AnxA2, ähnlich wie bei AnkB und der retinalen Na/K-ATPase, bei P18, nach Schisis und Photorezeptorapoptose, auftrat. Bei weiteren Untersuchungen von Kv2.1 und Kv8.2 in Retinoschisin-defizienten Mäusen wurde mittels Western Blot Analyse eine Verringerung ihrer Proteinkonzentrationen, ebenfalls vor P14, insbesondere bei P10, nachgewiesen, während jeweils keine Auswirkung auf die Genexpression nachzuweisen war. Schließlich wurde die Kv-Kanalaktivität in Y-79 Zellen gemessen. Patch-Clamp Analysen und Live-Cell Calcium Imaging zeigten keine Auswirkungen von Retinoschisin auf den Kv-Kanal-vermittelten Kalium-Ionenfluss oder die Calcium-Homöostase.
Zusammenfassend geben die durchgeführten experimentellen Arbeiten neue Einblicke in die funktionelle und strukturelle Zusammensetzung des Retinoschisin-Na/K-ATPase-Komplexes und deuten auf die Bildung eines makromolekularen Komplexes in den inneren Segmenten der Photorezeptoren u.a. mit den Kanaluntereinheiten Kv2.1 und Kv8.2 hin. Damit liefern diese Befunde neue Erkenntnisse für die initialen pathologischen Prozesse der XLRS und könnten somit die Entwicklung neuer therapeutischer Optionen für diese derzeit unbehandelbare Krankheit fördern
Metadata last modified: 09 Aug 2022 05:26
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