![[img]](https://epub.uni-regensburg.de/style/images/fileicons/application_pdf.png) | License: Creative Commons Attribution 4.0 (12MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-534404
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.53440
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 16 December 2024 |
| Referee: | Dr. Steffen Pockes |
| Date of exam: | 15 December 2022 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry I (Prof. Elz) |
| Keywords: | bivalent ligands, fluorescent ligands, dopamine D1 receptor, histamine H3 receptor |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 53440 |
Abstract (English)
The dopamine D1 (D1R) and histamine H3 receptors (H3R) were reported to form heterodimers in vitro and in vivo. It was further shown that this receptor complex has the potential to reduce amyloid β-induced cell death, raising the question of its pharmaceutical potential for the treatment of neurodegenerative diseases, e.g. Alzheimer’s disease. The aim of the main project of this thesis was the ...
Abstract (English)
The dopamine D1 (D1R) and histamine H3 receptors (H3R) were reported to form heterodimers in vitro and in vivo. It was further shown that this receptor complex has the potential to reduce amyloid β-induced cell death, raising the question of its pharmaceutical potential for the treatment of neurodegenerative diseases, e.g. Alzheimer’s disease. The aim of the main project of this thesis was the synthesis of high affinity bivalent ligands, as pharmacological tools to target specifically the D1-H3 receptor heteromer. For the design of these bivalent ligands, previously published agonists and antagonists were selected and, based on structure-activity relationships, connection points were chosen for the connection to the spacers. Polyethylene glycol-based structures of different lengths were chosen as spacers. After the successful organic synthesis of the pharmacophores and spacers, all three parts were connected via a copper catalyzed alkine-azide cycloaddition to form the bivalent ligands. A total of 16 bivalent and 4 end-capped ligands was successfully synthesized. All compounds were pharmacologically characterized for their affinity and selectivity for the D1R and H3R, using radioligand and NanoBRET competition binding assays. Most of the bivalent ligands showed high binding affinity towards both receptors with structures 44 and 45 being the most affine ligands with Ki values in the one-digit nanomolar (D1R) and sub-nanomolar (H3R) range. Furthermore, these ligands are over 1000fold selective for the D1-like receptors over the D2-like receptors and over 100000fold selective for the H3R inside the histamine receptor family. The functional activity of representative bivalent ligands was determined using a tr-FRET cAMP detection assay. 45 was furthermore used in a neurotoxicity assay and could significantly reduce the amyloid β-induced cell death of mouse embryonal cortex cells in a concentration-dependent manner, confirming the neuroprotective potential of the target receptor complex.
In another project six fluorescent ligands for the D1R were synthesized, labeled by either the 5-TAMRA or DY549-P1 fluorescent dye. The affinity for the D1R was determined via radioligand competition binding assays and NanoBRET saturation binding assay. The most affine 5-TAMRA labeled ligand was determined as a silent antagonist using a BRET sensor and was successfully used to visualize D1Rs in transfected HEK-293T cells using confocal microscopy.
In a third project a 5-TAMRA labeled fluorescent ligand with sub-nanomolar binding affinity for the H3R was synthesized. This compound was successfully used as a fluorescent tracer in NanoBRET competition binding assays at the H3R. Furthermore, it enabled the visualization of the H3R in transfected HEK-293T cells via confocal microscopy and single molecule imaging of the H3R using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The ligand is therefore a versatile tool to further study the H3R.
Translation of the abstract (German)
Es wurde gezeigt, dass die Dopamin D1 (D1R) und Histamin H3 Rezeptoren (H3R) können Dimere sowohl in vitro als auch in vivo bilden. Weiterführende Arbeiten haben ergeben, dass dieser Rezeptorkomplex das Potential hat, den Amyloid β induzierten Zelltod von Neuronen zu verringern. Das warf die Frage auf, ob dieser Rezeptorkomplex ein pharmakologisches Potential für die Behandlung von ...
Translation of the abstract (German)
Es wurde gezeigt, dass die Dopamin D1 (D1R) und Histamin H3 Rezeptoren (H3R) können Dimere sowohl in vitro als auch in vivo bilden. Weiterführende Arbeiten haben ergeben, dass dieser Rezeptorkomplex das Potential hat, den Amyloid β induzierten Zelltod von Neuronen zu verringern. Das warf die Frage auf, ob dieser Rezeptorkomplex ein pharmakologisches Potential für die Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, wie Alzheimer hat. Das Ziel des Hauptprojektes dieser Arbeit war die Synthese von bivalenten Liganden als pharmakologische Werkzeuge um den D1-H3 Rezeptorheteromer spezifisch zu inhibieren. Basierend auf bereits publizierten Antagonisten und Agonisten für beide Rezeptoren wurden Zielstrukturen entworfen, die die Verbindung dieser Pharmakophore mit Linkern zu bivalenten Liganden erlauben. Polyethylenglykolbasierte Strukturen mit unterschiedlichen Längen wurden als Linker designt. Nach der erfolgreichen Synthese der Pharmakophore und Linker wurden alle drei Bausteine mittels einer Kupfer-katalysierten Alkin-Azid-Cycloaddition verknüpft. Mittels dieser Methode konnten 16 bivalente und vier endgecappte Liganden synthetisiert werden. Alle Liganden wurden anschließend auf ihre Affinität und ausgewählte Liganden auf ihre Selektivität für den D1R und H3R getestet. Dazu wurden kompetitive Radioligand- und NanoBRET-Bindungsassays durchgeführt. Die meisten der bivalenten Liganden zeigten eine sehr hohe Affinität für beide Rezeptoren, wobei die Strukturen 44 und 45 die bivalenten Liganden mit der höchsten Affinität sind mit Ki-Werten im einstellig nanomolaren (D1R) und sub-nanomolaren Bereich (H3R). Des Weiteren sind diese Verbindungen über 1000fach selektiv für den D1R und D5R verglichen mit den D2-4R und über 100000fach selektiv für den H3R innerhalb der Histamin Rezeptorfamilie. Die funktionelle Aktivität der Liganden wurde mittels eines tr-FRET cAMP Detektionsassays bestimmt. Zusätzlich wurde die Verbindung 45 in einem Neurotoxizitätsassay getestet und konnte den Amyloid β induzierten Zelltod von primären Mauskortexzellen signifikant vermindern. Diese Ergebnisse bestätigen das neuroprotektive Potential des D1-H3 Rezeptorheteromers.
In einem weiteren Projekt wurden sechs Fluoreszenzliganden für den D1R synthetisiert, die entweder mit dem 5-TAMRA oder DY549-P1 Fluoreszenzfarbstoff markiert wurden. Die Affinität dieser Liganden wurde mittels kompetitiven Radioligandbindungsassays und NanoBRET Sättigungsassays bestimmt. Der 5-TAMRA markierte Ligand mit der höchsten Affinität wurde als stiller Antagonist charakterisiert und konnte erfolgreich für die Visualisierung von D1Rs in transfizierten HEK293T Zellen mittels Konfokal Mikroskopie verwendet werden.
In einem dritten Projekt wurde ein 5-TAMRA markierter Fluoreszenzligand für den H3R synthetisiert. Dieser Ligand wurde erfolgreich als Fluoreszenzmarker in NanoBRET Bindungsassays verwendet. Des Weiteren ermöglicht er die Visualisierung von H3R in transfizierten HEK293T Zellen und die Einzelmolekülmikroskopie mittels TIRF-Mikroskopie. Daher ist diese Verbindung ein vielseitiges Werkzeug für weitere Forschung am H3R.
Metadata last modified: 16 Dec 2024 05:55
Owner only: item control page
Download Statistics