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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-536021
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.53602
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 24 January 2023 |
| Referee: | Prof. Dr. Bernhard H.F. Weber |
| Date of exam: | 14 December 2022 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Humangenetik |
| Keywords: | Vitronectin, Age-related macuald degeneration, rs704 |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 53602 |
Abstract (English)
Age-related macular degeneration (AMD) is a frequent disorder of the central retina. So far, the pathomechanisms of the disease are incompletely understood, precluding successful therapeutic strategies to address initiating events of the disease. In recent years, genome-wide association studies (GWAS) implicated a plethora of genetic variation affecting specific biological pathways, like ...
Abstract (English)
Age-related macular degeneration (AMD) is a frequent disorder of the central retina. So far, the pathomechanisms of the disease are incompletely understood, precluding successful therapeutic strategies to address initiating events of the disease. In recent years, genome-wide association studies (GWAS) implicated a plethora of genetic variation affecting specific biological pathways, like extracellular matrix (ECM) organization and function, complement activation and lipid/cholesterol metabolism, as determinants of AMD. Still to date, for most genetic variants associated with AMD the molecular and biological significance remains to be functionally defined.
In this doctoral thesis, a functional investigation of the AMD-associated, non-synonymous rs704C>T variant within the VTN gene, originally reported by Fritsche and colleagues (2016), was conducted. This work aimed to explore the pathological significance of the amino acid substitution (T400M) resulting from rs704 in the encoded vitronectin, a circulatory and matricellular protein implicated previously in the pathology of AMD as a key component and coordinating factor of the abnormal extracellular deposits characteristic for the disease. To this end, the non-AMD risk-associated vitronectin isoform VTN_rs704:C and the AMD risk-associated VTN_rs704:T isoform were compared in a number of in vitro assays to assess the effects of rs704 on mRNA and protein expression, processing and functional aspects of vitronectin.
First, risk and non-risk associated VTN mRNA expression in human-induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived retinal pigment epithelium (RPE) and in retinal tissues from donors heterozygous for rs704 revealed no difference between the two VTN alleles. In turn, after heterologous expression in human embryonic kidney (HEK293-EBNA) and cultured RPE (ARPE-19) cells a dramatic increase in protein concentration and reduced endoproteolytic processing was found for the AMD risk-associated VTN_rs704:T isoform compared to the non-AMD risk-associated VTN_rs704:C isoform.
Second, after partial thermal denaturation both isoforms of vitronectin revealed similar susceptibility to trypsin digestion. Likewise, vitronectin isoforms exhibited an analogous multimerization, as demonstrated by Blue Native and non-reducing SDS-PAGE.
Third, in cell-binding assays, VTN_rs704:T relative to VTN_rs704:C showed a reduced ability to bind to the cell surfaces of ARPE-19, hiPSC-RPE and isolated porcine RPE cells, as well as to Y79 retinoblastoma cells and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Both isoforms of vitronectin similarly increased the adhesion of porcine-derived RPE and ARPE-19 cells. Furthermore, the two isoforms of vitronectin inhibited extracellular signal-regulated kinase (ERK) signalling in ARPE-19 cells, with VTN_rs704:C showing a greater effect than VTN_rs704:T. In HUVECs, vitronectin isoforms reduced adhesion and tubulogenesis, while only the non-risk VTN_rs704:C isoform slightly reduced migration. The analysis revealed no effect of vitronectin on the regulation of ERK signalling in HUVECs. Both isoforms of vitronectin failed to show any effect on autophagy and cell viability in HUVECs and ARPE-19 cells.
Fourth, after heterologous vitronectin expression in ARPE-19 cells, vitronectin isoforms increased the deposition and clustering of the integral ECM components fibronectin, elastin, and collagen, but not laminin. Furthermore, both isoforms increased the extracellular deposition of the angiogenic factor VEGF and the complement components C9 and CFH but had no effect on the deposition of the tissue inhibitor of metalloproteinase 3 (TIMP3). Interestingly, AMD risk-associated isoform VTN_rs704:T showed a stronger effect than non-risk-associated VTN_rs704:C.
Finally, the interaction of vitronectin isoforms with vitronectin binding partner plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1), an angiogenic regulator implicated in AMD pathology, was investigated. In co-precipitation experiments, AMD-associated VTN_rs704:T showed a stronger binding to PAI-1 than non-AMD-associated VTN_rs704:C, while in enzyme activity assays both isoforms similarly maintained PAI-1 activity. Exposure of ARPE-19 cells and HUVECs to VTN_rs704:C and VTN_rs704:T similarly increased expression and ECM deposition of PAI-1.
Taken together, the results of the thesis confirm and strengthen the contribution of vitronectin to the pathogenesis of AMD and suggest new biological pathways through which this protein might influence the pathological events leading to this devastating disease.
Translation of the abstract (German)
Die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) ist eine häufige Erkrankung der zentralen Netzhaut. Derzeit sind die Pathomechanismen der Krankheit nur unvollständig verstanden, was erfolgreiche therapeutische Strategien zur Bekämpfung der initialen Ereignisse der Krankheit wesentlich erschwert. In den letzten Jahren haben genomweite Assoziationsstudien (GWAS) eine Vielzahl von genetischen ...
Translation of the abstract (German)
Die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) ist eine häufige Erkrankung der zentralen Netzhaut. Derzeit sind die Pathomechanismen der Krankheit nur unvollständig verstanden, was erfolgreiche therapeutische Strategien zur Bekämpfung der initialen Ereignisse der Krankheit wesentlich erschwert. In den letzten Jahren haben genomweite Assoziationsstudien (GWAS) eine Vielzahl von genetischen Variationen aufgezeigt, die sich auf bestimmte biologische Prozesse auswirken, wie z. B. die Organisation und Funktion der extrazellulären Matrix (ECM), die Komplementaktivierung und den Lipid-/Cholesterinstoffwechsel, die allesamt für die AMD eine wichtige Rolle spielen. Bis heute ist die molekulare und biologische Bedeutung der meisten AMD-assoziierten genetischen Varianten jedoch funktionell nicht geklärt.
In dieser Dissertation wurde eine funktionelle Untersuchung der AMD-assoziierten, nicht-synonymen rs704C>T-Variante im VTN-Gen, (ursprünglich reportiert von Fritsche und Kollegen, 2016), durchgeführt. Die rs704C>T-Variante führt zu einer Aminosäuresubstitution T400M im kodierten Vitronectin-Protein, einem zirkulierenden und matrizellulären Protein, das schon früher in die Pathologie der AMD als Schlüsselkomponente und koordinierender Faktor der abnormen extrazellulären Ablagerungen, die für die Krankheit charakteristisch sind, impliziert wurde. Hierzu wurde die nicht AMD-risikoassoziierte Vitronectin-Isoform VTN_rs704:C und die AMD-risikoassoziierte Isoform VTN_rs704:T in einer Reihe von in vitro Tests verglichen, um die Auswirkungen von rs704 auf die mRNA- und Proteinexpression, die Prozessierung und weitere funktionelle Aspekte von Vitronectin zu überprüfen.
Die Analyse der mRNA-Expression in retinalem Pigmentepithel (RPE), das aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) differenziert wurde, und in Netzhautgewebe von Spendern, die heterozygot für rs704 waren, zeigte keine Auswirkung von rs704 auf die Transkription der beiden VTN-Isoformen. Nach heterologer Expression in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK293-EBNA) und kultivierten RPE-Zellen (ARPE-19) wurde für die AMD-assoziierte Isoform VTN_rs704:T im Vergleich zur nicht AMD-assoziierten Isoform VTN_rs704:C ein dramatischer Anstieg der Proteinkonzentration und eine reduzierte endoproteolytische Prozessierung festgestellt.
Beide Vitronectin-Isoformen zeigten nach partieller thermischer Denaturierung eine ähnliche Suszeptibilität für den Trypsin-Verdau. Über Blue Native und nicht-reduzierende SDS-PAGE wurde gezeigt, dass beide Vitronectin-Isoformen eine ähnliche Multimerisierung aufweisen.
In Versuchen, welche die Bindung der beiden Vitronectin-Isoformen an Zellen adressierten, zeigte VTN_rs704:T im Vergleich zu VTN_rs704:C eine reduzierte Bindefähigkeit an die Zelloberflächen von ARPE-19, hiPSC-RPE und isolierten porcinen RPE-Zellen sowie an Y79-Retinoblastomzellen und humanen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs).
Beide Isoformen von Vitronectin verstärkten in ähnlicher Weise die Adhäsion von porcinen RPE und ARPE-19 Zellen und führten zu einer Inhibierung des extrazellulären Signal-regulierten Kinase (ERK)-Signalwegs in ARPE-19-Zellen, wobei VTN_rs704:C hier eine stärkere Wirkung zeigte als VTN_rs704:T. In HUVECs reduzierten die Vitronectin-Isoformen Adhäsion und Tubulogenese, wohingegen nur die nicht risikoassoziierte Vitronectin-Isoform VTN_rs704:C die Migration dieser Zellen leicht reduzierte. Kein Einfluss von Vitronectin wurde auf die Regulierung des ERK-Signalwegs in HUVECs verzeichnet. Zudem zeigten beide Vitronectin-Isoformen Auswirkungen auf Autophagie und Zellviabilität von HUVECs und ARPE-19 Zellen.
Nach heterologer Vitronectin-Expression in ARPE-19 Zellen verbesserten die Vitronectin-Isoformen die extrazelluläre Ablagerung und das Clustering der integralen ECM-Komponenten Fibronektin, Elastin und Kollagen, aber nicht von Laminin. Darüber führten beide Vitronectin-Isoformen zu einer verstärkten extrazellulären Ablagerung des angiogenen Faktors VEGF und der Komplementkomponenten C9 und CFH, hatten aber keinen Effekt auf die extrazelluläre Ablagerung des Gewebsinhibitors der Metalloproteinasen-3 (TIMP3). Interessanterweise zeigte die risikoassoziierte AMD-Isoform VTN_rs704:T dabei eine stärkere Wirkung als die nicht risikoassoziierte Isoform VTN_rs704:C.
Schließlich wurde die Interaktion der Vitronectin-Isoformen mit dem Vitronectin-Bindungspartner Plasminogen-Aktivator-Inhibitoren (PAI-1), einem in der AMD-Pathologie involvierten Angiogenese-Regulator, untersucht. In Co-Präzipitationsexperimenten zeigte AMD-assoziiertes VTN_rs704:T eine stärkere Bindung an PAI-1 als nicht-AMD-assoziiertes VTN_rs704:C, wohingegen in Enzymaktivitätstests beide Isoformen die PAI-1-Aktivität auf vergleichbare Weise stabilisierten. Die Exposition von ARPE-19 Zellen und HUVECs mit VTN_rs704:C und VTN_rs704:T erhöhte in ähnlicher Weise die Expression und ECM-Ablagerung von PAI-1.
Zusammengefasst wird durch die Ergebnisse der Arbeit der Beitrag von Vitronectin zur Pathogenese der AMD unterstützt. Darüber hinaus werden neue biologische Wege aufgezeigt, über die dieses Protein die pathologischen Prozesse, die zu dieser schweren Krankheit führen, beeinflussen könnte.
Metadata last modified: 26 Jan 2023 16:32
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