NRF2-Associated Antioxidant Stress Response in Age-Related Macular Degeneration (AMD)

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Abstract (German)

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine degenerative Erkrankung der zentralen Netzhaut und die führende Ursache für den Verlust der Sehkraft in Industriestaaten (Resnikoff et al., 2004). Neben dem zunehmenden Alter wird das individuelle Risiko, eine AMD zu entwickeln, von einer Konstellation aus genetischer Prädisposition und Umweltfaktoren beeinflusst. Oxidativer Stress wird als ...

Abstract (German)

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine degenerative Erkrankung der zentralen Netzhaut und die führende Ursache für den Verlust der Sehkraft in Industriestaaten (Resnikoff et al., 2004). Neben dem zunehmenden Alter wird das individuelle Risiko, eine AMD zu entwickeln, von einer Konstellation aus genetischer Prädisposition und Umweltfaktoren beeinflusst. Oxidativer Stress wird als wichtiger umweltbedingter Risikofaktor gesehen, jedoch müssen die genauen Pathomechanismen bezüglich der Beteiligung an der Krankheitsentstehung noch vollständig aufgeklärt werden. Die retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) sind einem hohen oxidativen Stress ausgesetzt. Der protektive Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2)-Signalweg ist ein Schlüsselelement der oxidativen Stressantwort in allen Zellarten, so auch dem RPE (Sachdeva et al., 2014; Rojo de la Vega et al., 2018).

In dieser Arbeit wurden die beiden Risikofaktoren (1) genetische Prädisposition und (2) oxidativer Stress kombiniert in einem Patienten-abgeleiteten RPE Modellsystem für AMD wiedergegeben, indem oxidativer Stress durch Natriumiodat (sodium iodate, SI) und Blaulicht (BL) in aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten RPE (hiPSC-RPE)- Zelllinien mit genetisch hohem oder niedrigem AMD Risiko induziert wurde. Geeignete experimentelle Protokolle für akute (24 h) und chronische (72 h) SI-Behandlung und akute (9 h) BL-Bestrahlung wurden etabliert und es wurde bestätigt, dass die Morphologie der RPE- Zellen und die Integrität des Zell-Monolayers durch die Behandlungen nicht beeinträchtigt wurden. Die NRF2-assoziierte oxidative Stressantwort der hiPSC-RPE-Zellen wurde durch Expressionsanalyse der NRF2-abhängigen antioxidativen Gene Hämoxygenase-1 (HMOX1) und NAD(P)H Dehydrogenase [Quinone] 1 (NQO1) untersucht. Die analysierten Zelllinien reagierten mit erhöhter mRNA- und Proteinexpression auf die Behandlungen. Hierbei induzierten SI und BL die zwei Gene in unterschiedlichen Ausmaßen. Die in vitro Daten zeigten keine signifikanten Unterschiede in der oxidativen Stressantwort zwischen Hoch- und Niedrigrisikozelllinien. Hieraus wurde geschlossen, dass eine genetische Veranlagung für AMD die NRF2-assoziierte oxidative Stressantwort nicht messbar beeinflusst.

In einem zusätzlichen Projekt wurden hiPSC-RPE Zellen mit Photorezeptoraußensegmenten (photoreceptor outer segments, POS) aus der Schweinenetzhaut gefüttert und damit ein physiologischer Stressor in das Modell integriert. Nachdem bestätigt wurde, dass alle Zelllinien POS phagozytieren konnten, wurde gezeigt, dass mit dem Lipidperoxidationsprodukt 4- Hydroxynonenal (HNE) modifizierte POS gegenüber lysosomalem Abbau stabilisiert wurden. Des Weiteren wurden physiologischer und physikalischer oxidativer Stress kombiniert untersucht, indem die hiPSC-RPE-Zellen für 7 Tage mit HNE-modifizierten POS inkubiert wurden, gefolgt von BL-Bestrahlung. Die POS-Phagozytose hatte keinen Einfluss auf die BL- induzierte HMOX1 und NQO1 mRNA Expression in den hiPSC-RPE-Zelllinien.

Translation of the abstract (English)

Age-related macular degeneration (AMD) is a degenerative disease of the central retina and the leading cause of vision loss in developed countries (Resnikoff et al., 2004). Besides increasing age, the individual risk for developing AMD results from a combination of both genetic predisposition and environmental factors. Oxidative stress is considered to be a major environmental risk factor, but ...

Translation of the abstract (English)

Age-related macular degeneration (AMD) is a degenerative disease of the central retina and the leading cause of vision loss in developed countries (Resnikoff et al., 2004). Besides increasing age, the individual risk for developing AMD results from a combination of both genetic predisposition and environmental factors. Oxidative stress is considered to be a major environmental risk factor, but the exact pathomechanisms regarding its implication in disease development are yet to be fully resolved. The cells of the retinal pigment epithelium (RPE) are highly exposed to oxidative stress. A key element in the oxidative stress defense in the RPE, as in all cell types, is the protective nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2) signaling pathway (Sachdeva et al., 2014; Rojo de la Vega et al., 2018).

In the present study, two risk factors, namely genetic susceptibility and oxidative stress, were replicated combined in a unique patient-derived RPE model system for AMD by inducing oxidative stress in human induced pluripotent stem cell-derived RPE (hiPSC-RPE) cell lines carrying a defined high or low genetic AMD risk. Oxidative stress was induced with the chemical stressor sodium iodate (SI) and the physical stressor blue light (BL). Suitable experimental protocols for acute (24 h) and chronic (72 h) SI treatment and acute (9 h) BL irradiation were established and it was confirmed that RPE cell morphology and monolayer integrity showed no adverse effects due to the treatments. The NRF2-associated oxidative stress response of the hiPSC-RPE cells was investigated by analyzing the expression of the NRF2-responsive antioxidant genes Heme oxygenase 1 (HMOX1) and NAD(P)H dehydrogenase [quinone] 1 (NQO1). In all studied cell lines, mRNA and protein expression of HMOX1 and NQO1 were increased in response to the oxidative stress conditions. SI and BL induced the two genes in different orders of magnitude. The in vitro data revealed no significant differences in the oxidative stress response between high and low risk cell lines. Therefore, it was concluded that genetic predisposition to AMD seems rather unlikely to influence a NRF2- associated oxidative stress response.

In an additional project, a physiological stressor was introduced into the model system by feeding the hiPSC-RPE cells with photoreceptor outer segments (POS) isolated from porcine retinae. After confirming that the cell lines were capable of POS phagocytosis, it was demonstrated that POS modified with the lipid peroxidation product 4-Hydroxynonenal (HNE) were stabilized against lysosomal degradation. Furthermore, physiological and physical oxidative stressors were studied in combination by challenging the hiPSC-RPE cells with HNE- modified POS for 7 days followed by subsequent BL irradiation. POS phagocytosis did not influence BL-induced HMOX1 and NQO1 mRNA expression in the hiPSC-RPE cell lines.