Liquid-liquid phase separation (LLPS) describes a mechanism that results in the clustering of biomacromolecules, such as nucleic acids and proteins, into large microscopically visible foci. On a molecular level, LLPS is the result of a not fully characterized, redundant network of weak protein-protein and protein-RNA interactions. It is now widely understood that LLPS plays an important role in the formation of many membraneless organelles.
In this work, I used nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and biochemical assays to elucidate the intermolecular interactions that govern the LLPS of the yeast DEAD-box RNA helicase Definition of Essential Domain 1 (Ded1p), which is a main component of stress granules (SG). The Ded1p protein consists of a highly conserved helicase core of two folded RecA domains that constitute the active site and additional N- and C-terminal disordered extensions.
Based on an in vitro LLPS assay, I established that LLPS of Ded1p is mainly mediated by its C-terminal extension. Using paramagnetic relaxation enhancement (PRE) and spin relaxation experiments, the molecular grammar that governs the driving force of LLPS was identified for the C-terminal region. Tryptophan and arginine residues were shown to be highly potent stickers that dynamically drive condensation of the C‑terminal intrinsically disordered region (IDR) of Ded1p. My data also uncover a direct relationship between the mobility of individual amino acids and the importance of these residues for LLPS. Importantly, I established that these findings for the isolated IDR can be transferred to the LLPS behavior of the full-length protein. In addition, I identified interactions between the N- and C-terminal extensions and the folded helicase core that also contribute to LLPS.
In a second line of work, I used NMR titration experiments to study the interaction between the RecA core domains and their substrates adenosine triphosphate (ATP) and RNA. Based on five different DEAD-box helicases, I established a conserved energetic coupling between ATP and RNA binding, which is mediated by a conformational rearrangement of the RecA core domains. In the apo state, the RecA domains tumble independently, however, in the presence of both substrates, a transition to a rigid closed conformation takes place. The formation of this closed helicase core state is required for helicase unwinding activity in all tested DEAD-box RNA helicases.
Taken together, this work highlights the importance of IDRs for Ded1p LLPS and increases our understanding of the molecular mechanisms of DEAD-box RNA helicases.

Flüssig-flüssig-Phasentrennung (LLPS) ist ein Phänomen, bei dem sich Biomakromoleküle zu großen, mikroskopisch sichtbaren Tröpfchen zusammenlagern. Auf molekularer Ebene führt LLPS zur Bildung eines redundanten und bisher wenig charakterisierten Netzwerks, das aus schwachen Protein-Protein und Protein-RNA Wechselwirkungen besteht. Es ist inzwischen allgemein anerkannt, dass LLPS eine essentielle Rolle bei der Bildung von membranlosen Zellorganellen spielt.
In dieser Arbeit habe ich Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) und biochemische Experimente genutzt, um die intermolekularen Wechselwirkungen zu untersuchen, die zu LLPS des Hefeproteins Ded1p führen, einer DEAD-box RNA Helikase, die ein Hauptbestandteil von Stressgranula ist. Ded1p besteht aus einem hochkonservierten Helikasekern, der von zwei gefalteten RecA-Domänen besteht, die das aktive Zentrum bilden, sowie N- und C-terminalen ungefaltete Erweiterungen.
Basierend auf in vitro LLPS-Experimenten konnte ich herausfinden, dass LLPS von Ded1p hauptsächlich durch die C-terminale Erweiterung angetrieben wird. Mit Hilfe von paramagnetic relaxation enhancement (PRE) und Spinrelaxationsexperimenten konnte die molekulare Grammatik, welche LLPS der C-terminalen Region beschreibt, aufgeklärt werden. Dabei konnte ich herausfinden, dass Tryptophan- und Argininreste hochpotente Sticker-Reste sind, welche die Bildung von Kondensaten aus der C‑terminalen IDR von Ded1p dynamisch vorantreiben. Meine Daten belegen auch einen direkten Zusammenhang zwischen der Flexibilität einzelner Aminosäuren und der Bedeutung dieser Reste für LLPS. Ein weiteres wichtiges Ergebnis ist, dass sich das Phasentrennungsverhalten der isolierten C-terminalen IDR auch auf das Volllängeprotein Ded1p übertragen lässt. Darüber hinaus habe ich Wechselwirkungen zwischen den N- und C-terminalen Erweiterungen und dem gefalteten Helikasekern identifiziert, die ebenfalls zu LLPS beitragen.
In einer zweiten Studie untersuchte ich mit Hilfe von NMR-Titrationsexperimenten die Wechselwirkung zwischen den RecA-Kerndomänen und ihren Substraten ATP und RNA. Anhand von fünf verschiedenen DEAD-box RNA Helikasen konnte ich eine konservierte energetische Kopplung zwischen ATP- und RNA-Bindung nachweisen, die durch eine Konformationsänderung der RecA Kerndomänen vermittelt wird. Im apo-Zustand taumeln die RecA Domänen unabhängig voneinander, in Gegenwart beider Substrate findet jedoch ein Übergang in eine starre geschlossene Konformation statt. Die Ausbildung dieses geschlossenen Helikase-Kernzustands ist bei allen untersuchten DEAD-box RNA Helikasen für die Helikaseaktivität notwendig.
Insgesamt unterstreicht diese Arbeit die Bedeutung intrinsisch ungeordneter Proteinregionen für LLPS von Ded1p und erweitert unser Verständnis der atomaren Mechanismen von DEAD-box RNA Helikasen.