The role of E2F1 in cholangiocarcinoma - Potential therapeutic options - University of Regensburg Publication Server

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-552671
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.55267

Globuschütz, Tabea

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Date of publication of this fulltext: 05 Jan 2024 08:33

Details

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	4 January 2024
Referee:	Prof. Dr. Matthias Evert
Date of exam:	1 December 2023
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für Pathologie
Keywords:	1) Cholangiozelluläres Karzinom (CCA): aggressiver Tumor mit limitierten Therapieoptionen unter anderem durch oftmals späten Diagnosezeitpunkt bedingt 2) Untersuchung des Transkriptionsfaktor E2F1 und einiger regulatorischer Gene in humanen Tuomrproben, sowie CCA-Zelllinien 3) HLM006474 als E2F1-Inhibitor beeinflusst das Wachstumsverhalten von CCA-Zellen in der Zellkultur
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	55267

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Abstract (English)

Abstract (English)

Cholangiocarcinoma is a very aggressive form of tumor, which still has a very poor prognosis, due in part to the often late time of diagnosis and the limited response to current forms of therapy.
Therefore, it is necessary to work on new therapeutic approaches to improve the therapy and consequently the prognosis of CCA.
This work was focused on the transcription factor E2F1, which is known to play a key role in cell cycle progression through its position in the Rb-pathway. As being a master regulator, E2F1 has a lot of target genes with complex interactions. By occupying such a key position in cell division and proliferation, E2F1 is also important in the proliferation of tumor cells. In many tumor entities an overexpression of E2F1 has already been described, although the role seems to be complex with contradictory results.
In principle, this work can be divided into two experimental areas, based on the question of whether E2F1 can be used therapeutically in CCA:
On the one hand, human CCA samples were examined, always in direct comparison with healthy liver tissue from identical patients. Here, the expression of E2F1 and several target genes (Cyclin E, Cyclin B1, MCM2, MCM7, c-Myc, Cyclin D1, SKP2 and FOXM1) was investigated. In conclusion, no meaningful results could be obtained at the protein level; there were no clear expression differences between tumor tissue and tumor-free tissue. At the RNA level, clearer differences could be obtained in some cases, whereby the expected correlation could only be confirmed for E2F1 itself and MCM2. Most of the other target genes even showed increased expression patterns in healthy tissue, concluding that the investigation of 33 CCA tumor samples did not lead to support the hypothesis that E2F1 is a promising therapeutic target.
The second major experimental complex involved cell culture experiments with four CCA cell lines. In order to demonstrate the dependence of target genes on E2F1, E2F1 was suppressed by silencing and then the expression of target genes underneath was examined. From these results, it could be deduced that suppression of E2F1 significantly affects the expression of the target genes. Suppression over 50% starting from the expression in the control groups was detected here for MCM2,MCM7, SKP2 and RRM2.
Furthermore, the cell lines were treated with the E2F1 inhibitor HLM006474 at different concentration levels and subsequently their growth behavior was monitored. Basically, based on this experimental model, it can be concluded that the application of HLM006474 has effects on the growth behavior of the CCA cell lines, and the difference between 50 and 100 µM was mostly not large anymore. Together with the results from the silencing experiments, it can be supposed that a therapeutic inhibition of E2F1 is possible and should also affect some genes involved in tumorigenesis and proliferation.
Finally, the results of this work can be summarized by the fact that the investigation of the human CCA samples, although not allowing clear conclusions about the role of E2F1 and its target genes in CCA, the cell culture experiments nevertheless showed that E2F1 in CCA has an influence on the expression of the other target genes. Inhibition of E2F1 by HLM006474 affects growth behavior, so the results provide at least a starting point that the use of HLM006474 should be further investigated and new experimental models should be tested in vitro and in vivo and also should be expanded to include combination with already established CCA therapies to see if clinical use of HLM006474 could achieve good results in tumor treatment and if its use in humans would eventually be feasible.

Translation of the abstract (German)

Das cholangiozelluläre Karzinom (CCA) ist ein äußerst aggressiver Tumor, welcher nach wie vor eine sehr schlechte Prognose hat, was unter anderem auf den oftmals späten Diagnosezeitpunkt und das bedingte Ansprechen auf die gängigen Therapieformen zurückzuführen ist.
Daher ist es notwendig an neuen therapeutischen Ansätzen zu arbeiten, um die Therapie und damit einhergehend auch die Prognose des CCA zu verbessern.
Fokus dieser Arbeit war der Transkriptionsfaktor E2F1, von dem bekannt ist, dass er beim Voranschreiten des Zellzyklus durch seine Stellung im Rb-Signalweg eine zentrale Rolle einnimmt. E2F1 beeinflusst die Expression vieler Gene bzw. tritt mit ihnen in Wechselwirkungen.
Durch die Einnahme einer solchen Schlüsselposition bei Zellteilung und Zellproliferation hat E2F1 auch bei der Proliferation von Tumorzellen eine große Bedeutung. In vielen Tumorentitäten wurde bereits eine Überexpression von E2F1 beschrieben, wenn die Rolle dennoch komplex scheint und es auch Tumorerkrankungen gibt auf die das nicht bzw. Gegenteiliges zu trifft.
Diese Arbeit lässt sich in zwei Versuchsbereiche aufteilen, basierend auf der Fragestellung, ob E2F1 im CCA therapeutisch genutzt werden kann.
Dafür wurden zum einen humane CCA Proben auf die Expression von E2F1 und einiger Zielgene (Cyclin E, Cyclin B1, MCM2, MCM7, c-Myc, Cyclin D1, SKP2 und FOXM1) untersucht, immer im direkten Vergleich mit gesunden Lebergewebe vom identischen Patienten. Auf Proteinebene konnten keine aussagekräftigen Ergebnisse erzielt werden, da sich keine deutlichen Expressionsunterschiede zwischen Tumorgewebe und tumorfreien Gewebe nachweisen ließen. Auf RNA-Ebene ließen sich zum Teil deutlichere Unterschiede herausarbeiten, wobei sich der erwartete Zusammenhang nur für E2F1 selbst und MCM2 auf signifikantem Niveau bestätigen ließ. Die meisten anderen Zielgene zeigten sogar widersprüchliche Expressionsmuster, wodurch sich abschließend kritisch ableiten lässt, dass die Untersuchung von 33 CCA Tumorproben in dieser Arbeit nicht dazu geführt hat, die Hypothese zu stützen, dass E2F1 ein vielsprechender therapeutischer Ansatzpunkt im CCA ist.
Der zweite große Versuchskomplex beinhaltete Zellkulturversuche mit vier CCA Zelllinien. Um hier die Abhängigkeit der Zielgene von E2F1 aufzuzeigen, wurde E2F1 mittels Silencing unterdrückt und dann die Expression der Zielgene darunter untersucht. Aus diesen Ergebnissen ließ sich ableiten, dass eine Unterdrückung von E2F1 die Expression der Zielgene deutlich beeinflusst, eine Unterdrückung über 50% ausgehend von der Expression in den Kontrollgruppen wurde hier für MCM2, MCM7, SKP2 und RRM2 nachgewiesen.
Des weiteren wurden die Zelllinien mit dem E2F1-Inhibitor HLM006474 in unterschiedlichen Konzentrationsstufen behandelt und anschließend ihr Wachstumsverhalten untersucht. Grundsätzlich kann anhand dieses Versuchmodells gesagt werden, dass die Anwendung von HLM006474 Auswirkungen auf das Wachstumsverhalten der CCA-Zelllinien hat, wobei der Unterschied zwischen 50 und 100 µM meist nicht mehr groß war. Zusammen mit den Ergebnissen aus den Silencing Versuchen, kann aber der Schluss gezogen werden, dass eine therapeutische Inhibierung von E2F1 zum einem möglich ist und zum anderen auch einige mit in die Tumorentstehung und-proliferation involvierte Gene beeinflussen dürfte.
Abschließend können die Ergebnisse dieser Arbeit dahingehend zusammengefasst werden, dass die Untersuchungen der humanen CCA Proben zwar keine eindeutigen Schlüsse über die Rolle von E2F1 und seine Zielgenen im CCA zulassen, aber die Zellkulturversuche dennoch zeigten, dass E2F1 im CCA Einfluss auf die Expression anderer Schlüsselgene hat. Eine Inhibierung von E2F1 durch HLM006474 beeinflusst das Wachstumsverhalten, so dass die Ergebnisse zumindest einen Ausgangspunkt dafür liefern, dass der Einsatz von HLM006474 weiter untersucht werden sollte. Neue Versuchsmodelle in vitro und in vivo sollten dafür zur Anwendung kommen und diese sollten auch um die Kombination mit bereits etablierten Therapieformen erweitert werden, um zu sehen, ob ein klinischer Einsatz von HLM006474 gute Ergebnisse in der Tumorbehandlung erzielen könnte und ein Einsatz im Menschen schlussendlich realisierbar wäre.

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