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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-555026
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.55502
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 13 February 2024 |
| Referee: | Prof. Dr. Bernhard Weber |
| Date of exam: | 16 January 2024 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Humangenetik |
| Keywords: | AMD, age related macular degeneration, age-related-macular-degeneration, altersbedingte Makuladegeneration, RPE, retinal pigment epithelium, retinales Pigmentepithel, VTN, Vitronectin, rs704, subretinal |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 55502 |
Abstract (German)
Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine komplexe genetische Erkrankung, die in vielen Ländern der westlichen Welt die häufigste Ursache für Erblinden in höherem Alter darstellt (Salimiaghdam et al., 2019). Die Risikofaktoren der AMD sind vielfältig und interindividuell unterschiedlich stark ausgeprägt (Chakravarthy et al., 2010). Ablösung und Absterben der Photorezeptoren, ...
Abstract (German)
Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine komplexe genetische Erkrankung, die in vielen Ländern der westlichen Welt die häufigste Ursache für Erblinden in höherem Alter darstellt (Salimiaghdam et al., 2019). Die Risikofaktoren der AMD sind vielfältig und interindividuell unterschiedlich stark ausgeprägt (Chakravarthy et al., 2010). Ablösung und Absterben der Photorezeptoren, Veränderungen der Homöostase, sowie starke Einschränkungen subretinaler Phagocytose-Mechanismen führen zu progredientem Verlust des Sehvermögens der Betroffenen (Van Lookeren Campagne et al., 2014). Alle diese Faktoren können durch die Genetik beeinflusst werden (DeAngelis et al., 2017).
Der Polymorphismus rs704 im VTN-Gen auf Chromosom 17 konnte in aktuellen GWAS als eine AMD-assoziierte genetische Variante detektiert werden (Fritsche et al., 2016). Durch rs704 kommt es an Position 400 des Vitronectin-Proteins zu einem Aminosäureaustausch von Threonin zu Methionin. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Auswirkungen der unterschiedlichen Vitronectin-Varianten auf subretinale AMD-assoziierte Prozesse untersucht.
Hierfür wurden die nicht-AMD-assoziierte Variante VTN_rs704:C sowie die AMD-assoziierte Variante VTN_rs704:T heterolog in HEK-293-EBNA-Zellen exprimiert, aufgereinigt und in funktionellen Analysen eingesetzt.
In Versuchen zur zellulären Adhäsion retinaler Zellen (Weri-Rb1-Zellen und dissoziierte Zellen porciner Netzhaut) konnten unterschiedliche Effekte von Vitronectin auf die Adhäsion der beiden Zelltypen gezeigt werden: Ein verstärkender Einfluss auf die Adhäsion von Weri-Rb1-Zellen und ein inhibitorischer Einfluss auf die Adhäsion der porcinen Netzhautzellen. Dabei wurde kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den beiden Vitronectin-Varianten gefunden.
Weiter wurden nach Induktion von oxidativem Stress auf Retinoblastom-Zellen Effekte der Vitronectin-Varianten auf Apoptose- und Autophagie-Induktion untersucht und die intrazelluläre Signalwegs-Aktivierung analysiert. Für oxidativ gestresste Zellen zeigte sich hierbei eine geringfügig erhöhte Rate an Apoptose bzw. Autophagie, wobei die AMD-assoziierte Variante VTN_rs704:T einen leichten Apoptose-inhibierenden Effekt ausübte. Beide Vitronectin-Varianten wiesen tendenziell einen (statistisch nicht signifikanten) stimulierenden Effekt auf die Autophagie auf. In der Analyse der ERK1/2- bzw. AKT-Signalwegsaktivierung zeigt sich für alle oxidativ gestressten Proben eine tendenzielle Steigerung der ERK1/2- und AKT-Phosphorylierung (und somit Aktivierung) im Vergleich zu allen nicht gestressten Proben. Unter Vitronectin-Behandlung konnte dabei eine etwas stärkere ERK1/2-Phosphorylierung beobachtet werden, am stärksten fiel dieser Effekt mit der AMD-assoziierten Vitronectin-Variante VTN_rs704:T aus. Die AKT-Phosphorylierung fiel in den Vitronectin-behandelten Proben geringer aus, die AMD-assoziierte Variante zeigte dabei den geringsten Effekt auf die AKT-Phosphorylierung.
Im dritten Teilprojekt wurde der Einfluss der Vitronectin-Varianten auf die Phagocytose und damit verbundene intrazelluläre Signalwegsaktivierung in hiPSC-RPE-Zellen untersucht. Beide Vitronectin-Varianten schienen die Aufnahme von Photorezeptor-Außensegmenten (isoliert aus porciner Netzhaut) zu inhibieren, ein statistisch signifikanter Unterschied wurde zwischen den Zellen nachgewiesen, die mit Kontrolleluat behandelt wurden und den Zellen, die mit der AMD-assoziierten Variante inkubiert wurden. In der Untersuchung der intrazellulären Signalwegsaktivierung konnte ein zeitabhängiger Rückgang des phosphorylierten ERK1/2 ohne wesentliche Unterschiede zwischen den Vitronectin-Varianten beobachtet werden. In den Analysen der SRC-Phosphorylierung konnte ebenfalls eine signifikante zeitabhängige Reduktion der Mengen an phosphoryliertem SRC beobachtet werden, wobei beide Vitronectin-Varianten zu fortgeschrittener Zeit einen leichten inhibitorischen Effekt auf die Phosphorylierung zeigten.
Zusammengefasst zeigen die Versuche einen Einfluss des Vitronectins auf subretinale, AMD-assoziierte Prozesse. Inwiefern diese jedoch in vivo zur AMD-Pathogenese beitragen, bedarf weiterer Forschung.
Translation of the abstract (English)
Age-related macular degeneration (AMD) is a complex genetic disease and the major cause of legal-blindness in elderly people in many western countries (Salimiaghdam et al., 2019). Risk factors of AMD are widespread and vary strongly between individuals (Chakravarthy et al., 2010). Changes in photoreceptor homeostasis, detachment and cell death together with dysregulation of subretinal ...
Translation of the abstract (English)
Age-related macular degeneration (AMD) is a complex genetic disease and the major cause of legal-blindness in elderly people in many western countries (Salimiaghdam et al., 2019). Risk factors of AMD are widespread and vary strongly between individuals (Chakravarthy et al., 2010). Changes in photoreceptor homeostasis, detachment and cell death together with dysregulation of subretinal RPE-phagocytosis of photoreceptor-outer-segments, lead to progredient vision loss finally (Van Lookeren Campagne et al., 2014). All these factors can be influenced by genetics (DeAngelis et al., 2017).
The polymorphism rs704 in VTN-gene on chromosome 17 was detected in latest GWAS by Fritsche and colleagues to be a genetic variant associated with AMD (Fritsche et al., 2016). It causes a change from threonine to methionine at amino acid position 400. Within this thesis, the effect of vitronectin isoforms on subretinal AMD-associated processes was investigated.
For functional analyses, both protein-isoforms were heterologously expressed in HEK-293-EBNA cells, subsequently purified, and used in several experimental approaches.
First experiments on cellular adhesion of retinal cells (Weri-Rb1 cells and dissociated cells of porcine retina) revealed divergent effects of vitronectin on the adhesion of these two cell types: a promoting influence of vitronectin on Weri-Rb1 adhesion and an inhibitory influence on the adhesion of porcine retinal cells. No statistically significant differences were detected between the vitronectin isoforms.
In a second project following the consequences of oxidative stress in retinoblastoma cells, the effect of the vitronectin isoforms on apoptosis and autophagy induction, as well as on intracellular signaling was investigated. Oxidatively stressed cells showed slightly increased rate of apoptosis and autophagy, with a slight apoptosis-inhibiting effect of the AMD-associated isoform VTN_rs704:T. Both vitronectin isoforms seemed to have a stimulatory (but statistically not significant) effect on autophagy. Analyzing ERK1/2- and AKT-signaling, all H2O2-treated samples showed a tendentially increased ERK1/2 and AKT-phosphorylation (and thus activation) in comparison to non-stressed samples. Under vitronectin treatment, a stronger ERK1/2-phosphorylation was detectable, being strongest with the AMD-associated vitronectin isoform VTN_rs704:T. AKT-phosphorylation was decreased in vitronectin treated samples, with the weakest effect shown for AMD-associated isoform.
Thirdly, influence of the two vitronectin isoforms on phagocytosis and associated intracellular signaling by hiPSC-RPE cells has been analyzed. Both vitronectin isoforms seemed to inhibit uptake of photoreceptors-outer-segments (isolated from porcine retina), a statistically significant difference was observed between cells treated with control eluate and cells treated with the AMD-associated vitronectin isoform. Analyzing intracellular signaling during phagocytosis, a gradual decrease of phosphorylated ERK1/2 was observed, without any differences between vitronectin and control treated cells. Analyzing SRC phosphorylation, a significant time-dependent reduction of phosphorylated SRC was detected, with both vitronectin isoforms showing a slightly inhibitory effect on SRC phosphorylation with increasing incubation time.
Taken together these experiments show an influence of vitronectin on subretinal AMD-associated processes. Whether this also affects AMD-pathogenesis in vivo, remains to be clarified.
Metadata last modified: 13 Feb 2024 08:51
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