Within this work, the question whether the mechanisms of deoxyribonucleic acid (DNA)-dependent ribonucleic acid (RNA) Polymerase I (Pol I) activation and hibernation are conserved in yeast has been addressed. Pol I is a specialised enzyme that transcribes ribosomal RNA (rRNA) genes in all eukaryotes. Until recently, all published eukaryotic Pol I structures have been solved from the baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae).
Thus far, the storage of Pol I in an inactive dimeric conformation relies on S. cerevisiae-specific elements such as the ‘connector’. Furthermore, it is unclear whether structural elements such as the ‘expander’ operate similarly in homologous enzymes from other organisms. Enzymatic activation by ‘cleft’ contraction following the rotation of the central polymerase modules is believed to be of paramount importance but was not yet observed in any other species.
Like S. cerevisiae, the fission yeast Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) is an equally valuable model organism bridging the evolutionary gap towards Homo sapiens (H. sapiens) and was thus chosen for this investigation. To answer the research questions, Pol I from S. pombe was extracted and purified for subsequent structural and functional characterisation by single-particle electron cryo-microscopy (cryo-EM) and in vitro transcription assays.
This work provides the first published structures of Pol I from an organism other than S. cerevisiae in an inactive monomeric and an actively elongating state solved at high resolution using single-particle cryo-EM. Surprisingly, it was found that Pol I dimerization can occur independently of the A43 ‘connector’ domain and the cryo-EM reconstruction of such a dimer could be solved. The architecture of S. cerevisiae and S. pombe Pol I is similar, despite poor overall sequence identity. Comparative analysis of structural models derived from high-resolution reconstructions shows that a conserved contraction of the active centre cleft accomplishes activation. Overall, the results of this work support the hypotheses of Pol I activation by contraction and hibernation by dimerization. Only recently, new insights into the H. sapiens Pol I have been made available, allowing for an even more thorough discussion of the evolutionary conservation of structural features.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob die Mechanismen der Aktivierung und Speicherung der Desoxyribonukleinsäure (DNA)-abhängige Ribonukleinsäure (RNA)-Polymerase I (Pol I) in Hefe konserviert sind. Pol I ist ein spezialisiertes Enzym, das ribosomale RNA (rRNA)-Gene in allen untersuchten Eukaryonten transkribiert. Bis vor kurzem wurden alle publizierten eukaryotischen Pol I-Strukturen ausschließlich von der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) gelöst. Bislang ist die Speicherung von Pol I in einer inaktiven dimeren Konformation auf S. cerevisiae-spezifische Elemente wie den "connector" angewiesen. Darüber hinaus ist unklar, ob Strukturelemente wie z.B. der "expander" in homologen Enzymen anderer Organismen ähnlich funktionieren. Die Aktivierung des Enzyms durch Kontraktion der "cleft" nach der Rotation der zentralen Polymerasemodule ist vermutlich von entscheidender Bedeutung, wurde aber bisher bei keiner anderen Spezies beobachtet.
Die für diese Untersuchungen ausgewählte Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) ist ein ebenso wertvoller Modellorganismus, wie S. cerevisiae, der jedoch die evolutionäre „Lücke“ zum Homo sapiens (H. sapiens) verkürzen kann. Zur Beantwortung der Forschungsfragen, wurde Pol I aus S. pombe extrahiert und gereinigt, um anschließend die strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Enzyms mittels Einzelpartikel-Elektronen- Kryomikroskopie (cryo-EM) und in vitro Transkriptionstests durchzuführen.
Diese Arbeit liefert die ersten veröffentlichten Strukturen von Pol I aus einem anderen Organismus als S. cerevisiae in einem inaktiven monomeren und einem aktiv elongierenden Zustand, die mit hoher Auflösung unter Verwendung von Einzelpartikel-cryo-EM gelöst wurden. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die Dimerisierung von Pol I unabhängig von der A43-"connector"-Domäne erfolgen kann und die cryo-EM-Rekonstruktion eines solchen Dimers wurde gelöst. Die Architektur von S. cerevisiae und S. pombe Pol I zeigt, trotz geringer Sequenzidentität, hohe Ähnlichkeit auf. Eine vergleichende Analyse von Strukturmodellen, die aus hochauflösenden Rekonstruktionen abgeleitet wurden, zeigt, dass die Aktivierung durch eine konservierte Kontraktion des Spalts des aktiven Zentrums erreicht wird. Insgesamt unterstützen die Ergebnisse dieser Arbeit die Hypothesen der Aktivierung von Pol I durch Kontraktion und der Speicherung durch Dimerisierung. Erst kürzlich wurden neue Erkenntnisse über die Pol I von H. sapiens bekannt, die eine noch gründlichere Diskussion der evolutionären Konservierung von Strukturmerkmalen ermöglichen.