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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-582085
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.58208
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 28 April 2025 |
| Referee: | Prof. Dr. Gunter Meister |
| Date of exam: | 29 April 2024 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie I > Prof. Dr. Gunter Meister |
| Keywords: | RNA, Bind-n-Seq, RNA BNS, RBP, RBD, RNP, EDC4, WD40, β-propeller, RNA-protein complex |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 58208 |
Abstract (English)
RNA binding proteins are crucial effectors of gene expression. Post-transcriptional gene regulation is defined by specific RNA-protein interactions and to understand the function of an RBP, it is important to know its specific RNA targets. Many technologies have been developed for the identification of recognition motifs, such as RNA Bind-n-Seq (BNS). RNA BNS so far was exclusively conducted with ...
Abstract (English)
RNA binding proteins are crucial effectors of gene expression. Post-transcriptional gene regulation is defined by specific RNA-protein interactions and to understand the function of an RBP, it is important to know its specific RNA targets. Many technologies have been developed for the identification of recognition motifs, such as RNA Bind-n-Seq (BNS). RNA BNS so far was exclusively conducted with purified RBPs. Recombinant protein purification can often be challenging, and RNA affinities can be divergent because of purification-related truncations or the missing physiological context of an RBP candidate. Furthermore, RNA binding functions might be restricted to developmental stages or specific tissues. Therefore, we modified the original RNA BNS protocol from Lambert et al. (2014), introducing a second target RNA selection step. By increasing the specificity and resolution of target RNA selection, like in SELEX, we show that target RNA motifs can also be identified with endogenous RBPs and protein complexes, immunoprecipitated from cell lysates. We further demonstrate a quantification approach, that allows us to define an optimal concentration range of immunoprecipitated RBPs in our RNA BNS experiments. Improvements in our sample preparation finally allowed us to identify target RNA motifs of different RBPs from most various sources, including mouse brain and liver tissues. Since including the physiological context of an RBP in RNA BNS, we refer to this adapted method as endogenous RNA BNS (endo-bind-n-seq).
The Enhancer of decapping 4 (EDC4) is a protein that is highly involved in mRNA metabolism and P-body formation. It appeared as a potential new RBP candidate during high-throughput screenings of the last decade but never has been examined for mediating RNA contacts in detail. In this thesis, we examined the potential RNA binding function of EDC4 and tested its N-terminal WD40 domain as putative RBD. We aimed to recapitulate the screenings in more detail, including different EDC4 constructs. Thus, we performed a pull-down approach on immobilized pre-miRNA hairpins, testing for RNP complex formation with RNAs of known sequences, and performed CLIP experiments to investigate the interaction of EDC4 with endogenous RNAs of unknown sequences. By applying our optimized endo-bind-n-seq approach on immunoprecipitated EDC4 and its isolated WD40 domain, we identified a putative RNA binding motif of EDC4 and identified the EDC4 WD40 domain as a specific interactor of canonical GU- and AU-rich RNA motifs that are typically found as regulatory elements in the 3’ UTR of mRNAs. Based on AlphaFold predictions and the example of earlier solved β-propeller RNP complex structures, we finally hypothesize about a potential RNA binding mode of the EDC4 WD40 domain as a new RBD.
Translation of the abstract (German)
RNA-bindende Proteine sind entscheidende Effektoren der Genexpression. Die post-transkriptionelle Genregulierung wird durch spezifische RNA-Protein-Interaktionen definiert und um die Funktion eines RBP zu verstehen ist es wichtig, seine spezifischen RNA-Ziele zu kennen. Für die Identifizierung von Erkennungsmotiven wurden viele Technologien entwickelt, wie z. B. RNA Bind-n-Seq (BNS). RNA-BNS ...
Translation of the abstract (German)
RNA-bindende Proteine sind entscheidende Effektoren der Genexpression. Die post-transkriptionelle Genregulierung wird durch spezifische RNA-Protein-Interaktionen definiert und um die Funktion eines RBP zu verstehen ist es wichtig, seine spezifischen RNA-Ziele zu kennen. Für die Identifizierung von Erkennungsmotiven wurden viele Technologien entwickelt, wie z. B. RNA Bind-n-Seq (BNS). RNA-BNS wurde bisher ausschließlich mit aufgereinigten RBP Kandidaten durchgeführt. Die Aufreinigung von rekombinanten Proteinen kann oft schwierig sein, und die RNA-Affinitäten können aufgrund von strategischen Sequenzverkürzungen oder dem fehlenden physiologischen Kontext eines RBP-Kandidaten voneinander abweichen. Darüber hinaus kann die RNA-Bindungsfunktion eines Kandidaten in verschiedenen Entwicklungsstadien oder in bestimmten Geweben abweichen. Daher haben wir das ursprüngliche RNA-BNS-Protokoll von Lambert et al. (2014) modifiziert und einen zweiten Selektionsschritt zur Auswahl der Ziel-RNA eingeführt. Durch die Erhöhung der Spezifität und Auflösung der Ziel-RNA-Selektion ähnlich zu SELEX, zeigen wir, dass Ziel-RNA-Motive auch mit endogenen RBPs und Proteinkomplexen, die aus Zelllysaten immunpräzipitiert wurden, identifiziert werden können. Darüber hinaus demonstrieren wir einen Quantifizierungsansatz, der es uns ermöglicht, einen optimalen Konzentrationsbereich für immunpräzipitierte RBPs in unseren RNA-BNS-Experimenten zu definieren. Durch Verbesserungen bei der Probenvorbereitung konnten wir schließlich die RNA-Zielmotive verschiedener RBPs aus den unterschiedlichsten Quellen identifizieren, einschließlich Maus-Gehirn und Maus-Lebergewebe. Da wir den physiologischen Kontext eines RBP in RNA-BNS einbeziehen, bezeichnen wir diese angepasste Methode als endogenes RNA-BNS (endo-bind-n-seq).
Der Enhancer of decapping 4 (EDC4) ist ein Protein, das stark in den mRNA-Stoffwechsel und die Bildung von P-bodies involviert ist. Er erschien das erste mal als ein potenzieller neuer RBP-Kandidat während Hochdurchsatz-Screenings des letzten Jahrzehnts, wurde aber nie im Detail auf seine Funktion als direkter RNA-Interaktor hin untersucht. In dieser Arbeit analysierten wir die potenzielle RNA-Bindefunktion von EDC4 und testeten dessen N-terminale WD40-Domäne als mutmaßliche RBD. Unser Ziel war es, die Hochdurchsatz-Screenings detaillierter zu rekapitulieren und dabei verschiedene EDC4-Konstrukte zu untersuchen. So führten wir einen Pull-Down-Assay an immobilisierten pre-miRNA-hairpins durch, um die Bildung von spezifischen RNP-Komplexen mit RNAs bekannter Sequenz zu testen, und führten CLIP-Experimente durch, um die Interaktion von EDC4 mit endogenen RNAs unbekannter Sequenzen zu untersuchen. Durch Anwendung unserer optimierten endo-bind-n-seq Methode für immunoprezipitiertes EDC4 und dessen isolierte WD40-Domäne konnten wir ein mutmaßliches RNA-Bindungsmotiv von EDC4 identifizieren und die EDC4-WD40-Domäne als spezifischen Interaktor kanonischer GU- und AU-reicher RNA-Motive ausmachen, die typischerweise als regulatorische Elemente in der 3'-UTR von mRNAs zu finden sind. Auf der Grundlage von AlphaFold-Vorhersagen und dem Beispiel bereits zuvor gelöster β-Propeller RNP-Komplexstrukturen stellten wir schließlich eine Hypothese zu einem potenziellen RNA-Bindungsmodus der EDC4-WD40-Domäne als neue RBD auf.
Metadata last modified: 28 Apr 2025 06:50
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