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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-582905
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.58290
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 22 May 2024 |
| Referee: | Prof. Dr. Bernhard Weber |
| Date of exam: | 3 May 2024 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Humangenetik |
| Keywords: | BEST1; Bestrophin-1; Bestrophinopathien; Patch Clamp |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 58290 |
Abstract (German)
Das retinale Pigmentepithel (RPE) stellt eine wichtige einschichtige Zellschicht zwischen der äußeren Netzhaut (Retina) und der Aderhaut (Choroidea) im menschlichen Auge dar. Transportprozesse und Stoffwechselvorgänge dieser Zellen tragen dazu bei, die Funktionalität der Sinnesrezeptoren der Netzhaut aufrechtzuerhalten. Ein wichtiger Akteur in diesen Transportvorgängen ist das im RPE basolateral ...
Abstract (German)
Das retinale Pigmentepithel (RPE) stellt eine wichtige einschichtige Zellschicht zwischen der äußeren Netzhaut (Retina) und der Aderhaut (Choroidea) im menschlichen Auge dar. Transportprozesse und Stoffwechselvorgänge dieser Zellen tragen dazu bei, die Funktionalität der Sinnesrezeptoren der Netzhaut aufrechtzuerhalten. Ein wichtiger Akteur in diesen Transportvorgängen ist das im RPE basolateral lokalisierte Kanalprotein BEST1. Dieses setzt sich aus fünf gleichen BEST1 Untereinheiten zusammen und bildet einen Ionenkanal, der Chloridionen aus den RPE Zellen abtransportiert. Mutationen im zugrunde liegenden hBEST1-Gen sind ursächlich für Funktionseinschränkungen als Folge einer fehlerhaften Cl--Leitfähigkeit, die je nach Art und Lokalisation der Mutation zu unterschiedlichen monogenen Netzhauterkrankungen führen können. Dazu zählen die autosomal-dominante Best´sche vitelliforme Makuladegeneration (Morbus Best), die autosomal-dominante Vitreoretinochoroidopathie (ADVIRC) und die autosomal-rezessive Bestrophinopathie (ARB). Bislang besteht für keine dieser Erkrankungen eine effektive Therapie. Studien der letzten Jahre zeigen bereits erste vielversprechende positive Effekte für einige Wirkstoffe. Auch am Institut für Humangenetik der Universität Regensburg wurde eine dieser Wirkstoffgruppen entdeckt, deren Effektivität zur Verbesserung der BEST1-Funktionalität mit Hilfe der Patch-Clamp Technik in dieser Arbeit direkt bestätigt werden sollte. Dafür standen aus Vorarbeiten vier Zelllinien aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen zur Verfügung, die zu RPE-Zellen ausdifferenziert worden waren. Die beiden Linien hiPSC-RPE BEST +/+ und die hiPSC-RPE LRRC8A -/- stellten dabei Positivkontrollen mit endogen exprimierten nativen BEST1 Untereinheiten dar, während hiPSC-RPE BEST -/- eine Negativkontrolle darstellte, die kein BEST1 synthetisieren konnte. In der Patienten-abgeleiteten Linie hiPSC-RPE BEST +/R218C sollte dann die gefundene Wirkstoffgruppe überprüft werden. Zudem wurden auch Messungen an zwei weiteren Zelllinien (HEK293T und Y79) vorgenommen, um die Kapazität, den Anstieg der Stromantwort im Zeitverlauf und die Stromdichte bei Verwendung einer 0,38 µM Ca2+ enthaltenden Intrazellulärlösung zur Induktion einer Cl--Leitfähigkeit charakterisieren und einordnen zu können. Signifikante Unterschiede zwischen den hiPSC-RPE Linien zeigten sich hierbei in der durchschnittlichen Größe der Zellen, welche über die Kapazität bestimmt werden konnte. Die beiden Knock-out Linien fielen durch ein im Vergleich zur Kontrolllinie BEST +/+ oder der Patienten-abgeleiteten Linie BEST +/R218C grundsätzlich erhöhtes Zellvolumen auf. In drei verschiedenen Versuchsansätzen mit unterschiedlichen Temperaturen und Ca2+-Konzentrationen konnten allgemeine Aktivierungseffekte, jedoch keine BEST1-assoziierten Unterschiede des Stromanstiegs oder der Stromdichte festgestellt werden. Bereits an diesem Punkt konnte somit keine Unterscheidung der unterschiedlichen hiPSC-RPE Linien festgestellt werden. Die Erhöhung der Ca2+-Konzentration führte zudem zu Messfehlern, die einen starken Einfluss auf die Verwertbarkeit der hier beobachteten Stromkurven hatten. Dadurch konnten Effekte von Wirkstoffderivaten auf die mutierten Kanaluntereinheiten nicht überprüft werden. Die Stromentwicklung in den hiPSC-RPE Linien unterschied sich dabei aber deutlich von den Aktivierungsverläufen, die in HEK293T und Y79 Zellen festgestellt werden konnten, und in diesen anderen Zellsystemen merklich geringer ausfielen. Eine intensive Fehlersuche zeigte, dass vermutlich eine unzureichende Aktivierung von BEST1 dem Messproblem zugrunde lag. Alternativ könnte ein Überlagern der Effekte durch unabhängige endogen exprimierte Kanäle in den hiPSC-RPE Zellen aufgetreten sein. In weiterführenden Untersuchungen sollte zunächst im Überexpressionssystem ein stabiles BEST1-Signal mithilfe des Patch Clamp Messverfahrens abgeleitet werden können, bevor die Fortsetzung von weiteren Messreihen mit den verfügbaren Wirkstoffderivaten sinnvoll erscheint.
Translation of the abstract (English)
The retinal pigment epithelium (RPE) is an important monolayer in the human eye, located between the outer retina and the choroid. Essential transport and metabolism processes of these cells maintain the functionality of the photoreceptors in the retina. One fundamental player in all those actions is the in RPE cells basolateral localized channel protein BEST1. This, five homologous subunits ...
Translation of the abstract (English)
The retinal pigment epithelium (RPE) is an important monolayer in the human eye, located between the outer retina and the choroid. Essential transport and metabolism processes of these cells maintain the functionality of the photoreceptors in the retina. One fundamental player in all those actions is the in RPE cells basolateral localized channel protein BEST1. This, five homologous subunits containing, ion channel eliminates Cl- ions from the cytoplasma. Mutations in corresponding hBEST1 gene lead to a diminished functionality of this process. Depending on the localisation of the mutation site there are different effects on the ion channel. Therefore a few different monogenetic diseases are known to be caused by mutated BEST1. The autosomal-dominant Best´s vitelliform macular degeneration (Best´s disease), autosomal-dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC) and autosomal-recessive bestrophinopathy (ARB) belong to that class. Until now no effective treatment option is known for any of those diseases. Former studies revealed a number of promising derivates, that could lead to an improvement of channel function. Also, at the institute of human genetics of the university of Regensburg an optional treatment substance has been identified and should now be tested directly in this work using patch-clamp electrophysiology to examine the effectiveness of different derivates. Four human induced pluripotent stem cell derived RPE cell lines have been established previously and were available for the experiments. Two of those cell lines were used as a positive control with endogenous expressed BEST1 subunits (hiPSC-RPE BEST +/+ and hiPSC-RPE LRRC8A -/-) whilst one served as a negative control without the possibility to produce BEST1 protein (hiPSC-RPE BEST -/-). The patient-derived line hiPSC-RPE BEST +/R218C was meant to be used for testing the promising treatment derivates. Furthermore, patch experiments were performed in HEK293T and Y79 cells to evaluate the reactions that occurred in the hiPSC-RPEs containing the characterisation by their capacitance, increase of current over time and their current density activated due to the presence of 0,38 µM of Ca2+ in the intracellular solution. Significant differences between the hiPSC-RPE lines could be seen in the average size of the cells, determined by their capacitance. Both knock-out lines showed an increased cell volume in comparison to the control line BEST +/+ or the patient-derived line BEST +/R218C. But when three variable settings with different temperature and Ca2+ concentrations were sat up to measure Cl- conductance, no differences between the hiPSC-RPE lines could be seen. Each revealed an activation per cell line but without any variance it must be concluded that no BEST1-associated effects have been recorded. So, even a differentiation at control level failed. Additionally, increase in Ca2+ concentration led to measurement errors, that displayed strong influence in interpreting the measured current traces. Therefore, effects of the tested derivates on mutated channel subunits in general couldn´t be proved. However, hiPSC-RPE cells always reached significant higher activation levels than HEK293T or Y79 cells did. After intensive exclusion of error sources, it seemed most likely that an insufficient activation of BEST1 was the reason for the measurement errors. An alternative occasion for those problems could have been the covering of BEST1 effects by other endogenous expressed channels in hiPSC-RPE cells. Further experiments now should at first try to generate a pure BEST1 patch clamp signal in overexpression systems until measurements with derivates could be continued.
Metadata last modified: 22 May 2024 07:35
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