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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-583591
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.58359
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 16 May 2025 |
| Referee: | PD Dr. Andrea Straßer |
| Date of exam: | 15 May 2024 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | GPCRs, histamine receptors, [35S]GTPγS, DMR, label-free, ligand characterization, G protein signalling pathway |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 58359 |
Abstract (English)
Histamine receptors belong to the class A of GPCRs. Expressed in a wide variety of tissues, they are involved in the regulation of many (patho-)physiological processes. H1R and H2R represent well-established drug targets and a variety of drugs are available on the market for the treatment of e.g., allergic reactions and reflux diseases and their involvement in other diseases is still the subject ...
Abstract (English)
Histamine receptors belong to the class A of GPCRs. Expressed in a wide variety of tissues, they are involved in the regulation of many (patho-)physiological processes. H1R and H2R represent well-established drug targets and a variety of drugs are available on the market for the treatment of e.g., allergic reactions and reflux diseases and their involvement in other diseases is still the subject of current research. In comparison, the full therapeutical potential of the structurally related H3 and H4 receptors is focus on ongoing research and only few drug candidates are approved or are in clinical trials for the treatment of neurological and immunological diseases. In the drug discovery process, knowledge of receptor functionality is of fundamental importance. Different assay technologies provide insights into such functional HR-ligand interactions.
Thus, to further complement the available battery of available assay one sub-project of this thesis was aiming to develop a [35S]GTPγS for the hH1R. For this purpose, the Sf9 membrane preparations, prepared generated by using the BaculoGOLD™ expression system, co-expressing the hH1R+RGS4 that were commonly used for the steady state GTPase and radioligand binding assays were used to optimize the assay conditions for the hH1R. It turned out that by supplementing the assay buffer with of NaCl and saponin, concentration-response-curves for HIS could be obtained with moderate S/B ratio but low Z' factor. To further improve the assay conditions, the Bad-to-BacTM expression system was introduced for the preparation of Sf9 membrane preparations. This system was found to further improve both hH1R expression but also the quality of the assay. Characterization of several H1R ligands with the [35S]GTPγS assay provided functional data comparable to reference data from the literature.
The label-free DMR assay represents an emerging technique which was proven to be a helpful and versatile tool to study integrated signaling events non-invasively and in real-time using living cells. To elucidate the signal transduction of all four histamine receptors from a holistic perspective, the label-free DMR assay was developed for the hH1-4Rs. Aiming to create equal starting conditions for all four receptor subtypes for a better comparison of the results, the receptors were uniformly cloned and stably expressed in HEK293T cells. Stimulation of the engineered HEK hH1-4R cells lines with HIS elicited a positive deflected and concentration-dependent DMR for all four HR subtypes which could be reverted by addition of a receptor specific antagonist. All four histamine receptor subtypes were constitutively active in this system, as also described in the literature. Evaluation of the signal quality occurred by calculating the S/B ratio using the area und the curve (AUC) showing exceptionally high values for both histamine and the standard inverse agonists. Also, the pEC50 values for HIS and a receptor specific inverse agonist were in good agreement with the literature data. The involvement of endogenous G proteins was explored by following a two-pronged approach, namely that of classical pharmacology (G protein modulators) and that of molecular biology (G knock-out HEK cells). It was shown that signal transduction of hH1–4Rs occurred mainly, but not exclusively, via their canonical G proteins. For example, in addition to Gαi/o, the Gαq/11 protein was proven to contribute to the DMR response of hH3,4Rs. Moreover, the Gα12/13 was identified to be involved in the hH2R mediated signaling pathway. Furthermore, the DMR assay was used for characterization of a set of (standard) HR ligands, including (partial) agonists, inverse agonists, and antagonists. A broad range of potencies and efficacies were experienced in the DMR assay in line with data from reference pathway specific assays.
Altogether, both the label-dependent [35S]GTPγS and the label-free DMR assay described in this thesis provide valuable and versatile alternatives for the functional characterization of HRs and their ligands.
Translation of the abstract (German)
Histamin Rezeptoren gehören zur Klasse A der GPCRs und kommen in einer Vielzahl von unterschiedlichen Geweben vor. Daher sind sie an der Regulierung vieler (patho-)physiologischer Prozesse beteiligt. H1R und H2R stellen gut etablierte Zielstrukturen für Arzneimittel dar und eine Reihe von Medikamenten zur Behandlung von z. B. allergischen Reaktionen und Refluxerkrankungen sind auf dem Markt ...
Translation of the abstract (German)
Histamin Rezeptoren gehören zur Klasse A der GPCRs und kommen in einer Vielzahl von unterschiedlichen Geweben vor. Daher sind sie an der Regulierung vieler (patho-)physiologischer Prozesse beteiligt. H1R und H2R stellen gut etablierte Zielstrukturen für Arzneimittel dar und eine Reihe von Medikamenten zur Behandlung von z. B. allergischen Reaktionen und Refluxerkrankungen sind auf dem Markt erhältlich. Demgegenüber ist das volle therapeutische Potenzial der miteinander strukturell verwandten H3- und H4-Rezeptoren Gegenstand aktueller Forschung. Bislang sind nur wenige Arzneimittelkandidaten für die Behandlung neurologischer und immunologischer Erkrankungen zugelassen oder befinden sich in der klinischen Prüfung. Bei der Entwicklung von Arzneimitteln ist die Kenntnis der Rezeptorfunktionalität von grundlegender Bedeutung. Die Untersuchung funktioneller Interaktionen zwischen HR-Liganden und Rezeptoren erfolgt mittels unterschiedlicher Assay-Technologien.
Ein Teilprojekt dieser Arbeit zielte auf die Entwicklung eines [35S]GTPγS Assays für den hH1R ab, um das verfügbare Assay-Repertoire zu erweitern. Hierfür wurden die mit dem BaculoGOLD™-Expressionssystem hergestellten Sf9-Membranpräparate, die hH1R+RGS4 ko-exprimieren und üblicherweise für die Steady-State-GTPase- und Radioligandenbindungsassays verwendet wurden, zur Optimierung der Assay-Bedingungen für hH1R eingesetzt. Es konnte festgestellt werden, dass durch die Ergänzung des Assay-Puffers mit NaCl und Saponin Konzentrationswirkungskurven für HIS mit moderatem S/B-Verhältnis, jedoch mit niedrigem Z'-Faktor erhalten werden konnten. Um die Assay-Bedingungen dahingehend weiter zu optimieren, wurde das Bad-to-BacTM-Expressionssystem für die Herstellung von Sf9-Membranpräparaten eingeführt. Es konnte nachgewiesen werden, dass dieses System sowohl die hH1R-Expression als auch die Qualität des Assays weiter verbessert. Die Charakterisierung einiger H1R-Liganden mit dem [35S]GTPγS-Assay lieferte funktionelle Daten, die mit Referenzdaten aus der Literatur vergleichbar sind.
Der markierungsfreie DMR-Assay stellt eine neuartige Technik dar, die sich als hilfreiches und vielseitiges Instrument zur nicht-invasiven Untersuchung ganzheitlicher Signalereignisse in lebenden Zellen in Echtzeit erwiesen hat. Um die Signaltransduktion aller vier Histamin Rezeptoren aus einer ganzheitlichen Perspektive zu erforschen, wurde der markierungsfreie DMR-Assay für die hH1-4Rs entwickelt. Um gleiche Ausgangsbedingungen für alle vier Rezeptor-Subtypen zu schaffen und die Ergebnisse besser vergleichen zu können, wurden die Rezeptoren einheitlich kloniert und in HEK293T-Zellen stabil exprimiert. Die Stimulation der gentechnisch veränderten HEK hH1-4R-Zelllinien mit HIS löste bei allen vier HR-Subtypen ein positives und konzentrationsabhängiges DMR-Signal aus, welches durch Zugabe eines rezeptorspezifischen Antagonisten inhibiert werden konnte. In Übereinstimmung mit den Literaturdaten, waren alle vier Histamin Rezeptor-Subtypen in diesem System konstitutiv aktiv. Die Bewertung der Signalqualität erfolgte durch Berechnung des S/B-Verhältnisses anhand der Fläche unter der Kurve (AUC), welches sowohl für HIS als auch für die inversen Agonisten außergewöhnlich hohe Werte aufwies. Auch die pEC50-Werte für HIS und einen rezeptorspezifischen inversen Agonisten zeigten eine gute Übereinstimmung mit den Literaturdaten. Die Beteiligung endogener G-Proteine wurde mit einem zweigleisigen Ansatz untersucht, nämlich dem der klassischen Pharmakologie (Einsatz von G-Protein-Modulatoren) und dem der Molekularbiologie (Einsatz von G-Protein knock-out HEK-Zellen). Die Ergebnisse legten nahe, dass die Signaltransduktion von hH1-4Rs hauptsächlich, jedoch nicht ausschließlich, über ihre kanonischen G-Proteine erfolgt. So wurde beispielsweise nachgewiesen, dass neben Gαi/o auch das Gαq/11-Protein zur DMR-Antwort von hH3,4Rs beiträgt. Außerdem wurde festgestellt, dass das Gα12/13-Protein am hH2R-vermittelten Signalweg beteiligt ist. Darüber hinaus wurde der DMR-Assay zur Charakterisierung einer Reihe von (Standard-)HR-Liganden verwendet, darunter (Teil-)Agonisten, inverse Agonisten und Antagonisten. Im DMR-Assay wurde ein breites Spektrum an Potenzen und Effizienzen festgestellt, das mit den Daten aus Referenz-Assays für den Signalweg übereinstimmt.
Insgesamt bieten sowohl der markierungsabhängige [35S]GTPγS- als auch der markierungsfreie DMR-Assay, die in dieser Arbeit beschrieben wurden, wertvolle und vielseitige Alternativen für die funktionelle Charakterisierung von HRs und deren Liganden.
Metadata last modified: 16 May 2025 05:26
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