Die Oberflächenchemie von Nanopartikeln ist ein wichtiger Schritt auf dem Weg vom Partikeldesign zur Anwendung in biologisch relevanten Umgebungen. Hier wird eine auf einer Doppelschicht (Bilayer) basierende Strategie für die Oberflächenmodifikation von hydrophoben Nanopartikeln vorgestellt, die diesen eine ausgezeichnete kolloidale Stabilität in wässriger Umgebung und einen guten Schutz gegen Auflösung verleiht und gleichzeitig eine Oberflächenfunktionalisierung durch einfache Carbodiimid-Kopplungschemie ermöglicht. Wir haben das herausragende Potenzial dieser Strategie anhand von Upconversion-Nanopartikeln (UCNPs) demonstriert, die ursprünglich mit Oleat beschichtet und daher nur in organischen Lösungsmitteln dispergierbar waren. Die hydrophobe Oleatbeschichtung bleibt dabei erhalten und bildet nach Zugabe von weiterem Oleat eine Doppelschicht. Dieser Ansatz schützt vor Lumineszenzlöschung durch Wassermoleküle, während der Einbau zusätzlicher Moleküle mit Aminogruppen in die Doppelschicht deren kolloidale Stabilität erhöht und die Funktionalisierbarkeit erleichtert. Die biologische Relevanz des Ansatzes wurde durch die Verwendung von zwei Modellfarbstoffen gezeigt, einem Photosensibilisator und einer Stickoxid- (NO−) Sonde, die, wenn sie an die Oberfläche der UCNPs gebunden sind, ihre Funktionalität zur Erzeugung von Singulett-Sauerstoff bzw. zum Nachweis von intrazellulärem NO beibehalten. Wir stellen eine einfache und schnelle Methode zum Schutz und zur Funktionalisierung von anorganischen Nanopartikeln in biologischen Medien vor, die für die kontrollierte Oberflächengestaltung von Nanomaterialien für theranostische Anwendungen wichtig ist.