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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-586339
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.58633
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 23 June 2025 |
| Referee: | Prof. Dr. Frank Sprenger |
| Date of exam: | 20 June 2024 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Cell Cycle Control > Prof. Dr. Frank Sprenger |
| Keywords: | Dacapo, SCF-Rca1, E3 ubiquitin ligase |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 58633 |
Abstract (English)
Dacapo (Dap) – the Drosophila homolog of p21 and p27 – can inhibit CycE/Cdk2 and thereby block the transition from G1 phase to S phase of the cell cycle. Previous work showed that the E3 ubiquitin ligase CRL4-Cdt2 targets Dap for degradation. In addition, there were indications that the E3 ubiquitin ligase SCF-Rca1 could be involved in degradation of Dap. In this thesis data is shown, which ...
Abstract (English)
Dacapo (Dap) – the Drosophila homolog of p21 and p27 – can inhibit CycE/Cdk2 and thereby block the transition from G1 phase to S phase of the cell cycle. Previous work showed that the E3 ubiquitin ligase CRL4-Cdt2 targets Dap for degradation. In addition, there were indications that the E3 ubiquitin ligase SCF-Rca1 could be involved in degradation of Dap. In this thesis data is shown, which substantiates that Dap is a substrate of SCF-Rca1. Furthermore, important insights into the exact mechanisms by which Dap is recognized by CRL4-Cdt2 and SCF-Rca1 were obtained.
Dap contains in the C-terminus a so-called PIP degron, a short 12 amino acid long motif that is required to mediate ubiquitination by CRL4-Cdt2. The PIP degron allows binding to the DNA clamp PCNA (proliferating cell nuclear antigen) and this association is required to be recognized by Cdt2, the substrate recognition module. Here, it was shown that the first amino acid (Q184) of the PIP degron in Dap is crucial for binding to PCNA and an alanine mutation of Q184 impedes degradation via CRL4-Cdt2. In addition, it was shown that a basic cluster at the C-terminal part of the PIP degron in Dap is essential for its degradation. The basic cluster might mediate interaction with DNA or Cdt2. Furthermore, it was demonstrated that regions in the N-terminal part of Dap mediate interaction with Cdt2.
Rca1 is an F-box containing protein that can assemble into SCF-complexes. The target of an SCF-Rca1 ubiquitin ligase could be Dap. Overexpression or knockdown of Rca1 can influence the stability of Dap. However, in part, these effects on Dap were indirect by induced cell cycle distribution changes and subsequent degradation by CRL4-Cdt2. To eliminate, or at least reduce these indirect effects, different approaches were taken, such as knockdown of Cdt2 or mutation of the PIP degron. After the activity of CRL4-Cdt2 was strongly reduced by different strategies, overexpression of Rca1 still decreased the stability of Dap and knockdown of Rca1 increased its stability. This substantiates our theory that Dap is a substrate of SCF-Rca1.
The PIP degron, responsible for the CRL4-Cdt2 mediated degradation was completely absent in an N-terminal fragment of Dap (Dap_1-125). This fragment was destabilized by Rca1 overexpression or stabilized by knockdown of Rca1, respectively. Dap_1-125 still contains binding sites for CycE and Cdk2 and is able to inhibit the CycE/Cdk2 complex. Using Dap_1-125 constructs we were able to show that binding of Dap to CycE and Cdk2 is required for its degradation via SCF-Rca1. In addition, we demonstrated that the N-terminal part of CycE in the CycE/Cdk2/Dap complex is needed to destabilize Dap_1-125. Based on this and further data obtained in this thesis, we propose the following model for the degradation of Dap via SCF-Rca1: Dap (an IDP (intrinsically disordered protein)) binds CycE/Cdk2 in G1 phase to fulfill its role as inhibitor of CycE/Cdk2. To induce the G1/S transition at the end of G1 phase an unknown kinase phosphorylates Cdk2. This phosphorylation could allow restricted Cdk2 kinase activity that results in phosphorylation of the associated CycE in the N-terminal region. Subsequently, a kinase gets recruited to the phosphorylated site and could phosphorylate CycE in the C-terminal region and also Dap. Thereafter, phosphorylated Dap is recognized by SCF-Rca1. By this mechanism it could be ensured that only Dap, which already fulfilled its function in the cell cycle is targeted for degradation. This is in line with the regulation of other CKIs (inhibitors of Cyc/Cdk complexes), which are also only targeted for degradation after they have actively regulated the cell cycle.
Translation of the abstract (German)
Dacapo (Dap) – das Drosophila Homolog von p21 und p27 – kann CycE/Cdk2 inhibieren und dadurch den Übergang von der G1-Phase zu der S-Phase des Zellzyklus verhindern. Vorherige Arbeit zeigte, dass die E3 Ubiquitin Ligase CRL4-Cdt2 Dap für den Abbau markiert. Außerdem gab es Hinweise darauf, dass die E3 Ubiquitin Ligase SCF-Rca1 in den Abbau von Dap involviert sein könnte. In dieser Arbeit werden ...
Translation of the abstract (German)
Dacapo (Dap) – das Drosophila Homolog von p21 und p27 – kann CycE/Cdk2 inhibieren und dadurch den Übergang von der G1-Phase zu der S-Phase des Zellzyklus verhindern. Vorherige Arbeit zeigte, dass die E3 Ubiquitin Ligase CRL4-Cdt2 Dap für den Abbau markiert. Außerdem gab es Hinweise darauf, dass die E3 Ubiquitin Ligase SCF-Rca1 in den Abbau von Dap involviert sein könnte. In dieser Arbeit werden Daten gezeigt, welche bekräftigen, dass Dap ein Substrat von SCF-Rca1 ist. Des Weiteren wurden wichtige Einblicke in die genauen Mechanismen erhalten durch welche Dap von CRL4-Cdt2 und SCF-Rca1 erkannt wird.
Dap enthält in seinem C-terminus ein sogenanntes PIP-Degron, ein kurzes 12 Aminosäuren langes Motiv, welches für die Ubiquitinierung durch CRL4-Cdt2 benötigt wird. Das PIP degron ermöglicht die Bindung an die DNA-Klammer PCNA (proliferating cell nuclear antigen) und diese Assoziation wird benötigt, um von Cdt2, dem Substraterkennungsmodul, erkannt zu werden. Hier wurde gezeigt, dass die erste Aminosäure (Q184) des PIP-Degrons in Dap wichtig für die Bindung an PCNA ist und eine Alanin Mutation von Q184 den Abbau über CRL4-Cdt2 beeinträchtigt. Außerdem wurde gezeigt, dass ein basisches Cluster im C-terminalen Bereich des PIP-Degrons in Dap essentiell für dessen Abbau ist. Das basische Cluster vermittelt möglicherweise eine Interaktion mit DNA oder Cdt2. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Regionen in dem N-terminalen Bereich von Dap eine Interaktion mit Cdt2 vermitteln.
Rca1 enthält eine F-box und kann in einen SCF-Komplex eingebaut werden. Das Zielprotein der SCF-Rca1 Ubiquitin Ligase könnte Dap sein. Die Überexpression oder die Runterregulierung von Rca1 kann die Stabilität von Dap beeinflussen. Jedoch sind diese Effekte auf Dap teilweise indirekt durch induzierte Änderungen in der Zellzyklus-Verteilung und nachfolgendem Abbau durch CRL4-Cdt2. Um diese indirekten Effekte zu eliminieren oder zumindest zu reduzieren, wurden verschiedene Ansätze wie z.B. die Runterregulierung von Cdt2 oder die Mutation des PIP-Degrons verfolgt. Nachdem die Aktivität von CRL4-Cdt2 mit Hilfe verschiedener Strategien stark reduziert wurde, führte die Überexpression von Rca1 zu einer Abnahme der Stabilität von Dap und die Runterregulierung von Rca1 erhöhte dessen Stabilität. Dies bekräftigt unsere Theorie, dass Dap ein Substrat von SCF-Rca1 ist.
Das PIP-Degron, welches für den CRL4-Cdt2 vermittelten Abbau verantwortlich ist, fehlte vollständig in einem N-terminalen Fragment von Dap (Dap_1-125). Dieses Fragment wurde durch die Überexpression von Rca1 destabilisiert beziehungsweise durch die Runterregulierung von Rca1 stabilisiert. Dap_1-125 enthält immer noch Bindestellen für CycE und Cdk2, und kann den CycE/Cdk2-Komplex inhibieren. Mit Hilfe von Dap_1-125 Konstrukten konnten wir zeigen, dass Dap an CycE und Cdk2 binden muss, um über SCF-Rca1 abgebaut zu werden. Zusätzlich zeigten wir, dass der N-terminale Bereich von CycE in dem CycE/Cdk2/Dap-Komplex benötigt wird, um Dap zu destabilisieren. Basierend darauf und auf weiteren Daten in dieser Arbeit, schlagen wird das folgende Modell für den Abbau von Dap über SCF-Rca1 vor: Dap (ein IDP (intrinsically disordered protein)) bindet CycE/Cdk2 in der G1-Phase, um seine Rolle als Inhibitor von CycE/Cdk2 zu erfüllen. Um den G1/S-Übergang am Ende der G1-Phase zu induzieren, phosphoryliert eine unbekannte Kinase Cdk2. Diese Phosphorylierung könnte eine eingeschränkte Aktivität der Cdk2 Kinase erlauben was eine Phosphorylierung des assoziierten CycE in der N-terminalen Region zur Folge hat. Danach wird eine Kinase zu der phosphorylierten Stelle rekrutiert und könnte CycE in der C-terminalen Region und außerdem Dap phosphorylieren. Im Anschluss wird das phosphorylierte Dap von SCF-Rca1 erkannt. Durch diesen Mechanismus könnte sichergestellt werden, dass ausschließlich Dap, welches bereits seine Funktion im Zellzyklus erfüllt hat, für den Abbau markiert wird. Dies steht im Einklang mit der Regulation von anderen CKIs (Inhibitoren von Cyc/Cdk-Komplexen), welche ebenfalls nur dann für den Abbau markiert werden, nachdem diese aktiv den Zellzyklus reguliert haben.
Metadata last modified: 23 Jun 2025 06:58
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