Selektive HDAC6-Inhibitoren und „Proteolysis Targeting Chimeras“ (PROTACs): Synthese und biologische Testung

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-586441
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.58644

Scheuerer, Simon

License: Creative Commons Attribution 4.0
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Date of publication of this fulltext: 18 Jul 2024 08:21

Details

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	18 July 2024
Referee:	Prof. Dr. Siavosh Mahboobi
Date of exam:	12 June 2024
Institutions:	Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry I (Prof. Elz)
Keywords:	selektive HDAC6-Inhibtoren, PROTACs, Synthese, pharmakologische Charakterisierung
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 615 Pharmacy
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	58644

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Abstract (German)

Abstract (German)

Die Inhibition von HDAC6 hat sich u.a. bei der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und Tumorerkrankungen als nützlich erwiesen. Über die selektive Inhibition von HDAC6 verspricht man sich einen verminderten off-Target Effekt, welcher zu unerwünschten Nebenwirkungen führen kann. Zudem wird eine präzise Untersuchung der genauen biologischen Rolle und Effekte von HDAC6 durch die Inhibition anderer HDAC Isoformen stark erschwert. Ausgehend von Tubastatin A, und dem daraus abgeleitetem HDAC6-Inhibitor Marbostat-100, wurden verschiedenen Derivatisierungen an der Kopfgruppe vorgenommen, um die Wirkstärke, Selektivität und Stabilität zu verbessern. Über die Einführung unterschiedlicher Kohlenstoffsubstituenten am chiralen Zentrum von Marbostat-100 konnte die Hydrolyse der Dihydrouracil-Struktur und eine anschließende Decarboxylierung unterbunden werden. Dies führte im Fall von S-53b besonders im zellulären Aktivitäts-Assay zu einer effektiveren und deutlich verlängerten Wirkung auf die Tubulin-Acetylierung gegenüber Marbostat-100. Aus den synthetisierten Verbindungen wurde ein detailliertes Verständnis für die strukturellen Anforderungen der Enzymbindung ausgearbeitet, welches sich durch die Kristallstruktur des Inhibitors S-53b mit der zweiten katalytischen Domäne von Danio rerio HDCA6 untermauert lässt. Über die enantioselektive Synthese ausgewählter Verbindungen wird gezeigt, dass die Orientierung des Dihydrouracil-Ringes eine entscheidende Rolle bei der Bindung der synthetisierten Inhibitoren an HDAC6 spielt. Die Bewertung aller Zielstrukturen bezüglich der inhibitorischen Aktivität und Selektivität erfolgte über einen fluorometrischer Aktivitäts-Assay an rekombinanten Enzymen (HDAC1, 2, 3, 6 und 8). Die potentesten Verbindungen wurden zudem in einem zellulären Aktivitäts-Assays über die Bestimmung der Tubulin-Acetylierung mittels Western Blot untersucht. Die draus gewonnen Erkenntnisse dienten im Weiteren der Entwicklung neuer HDAC6-PROTACs, welche den direkten Abbau des Zielproteins über das Proteasom einleiten können. Mit die Kombination aus Marbostat-100 bzw. S-53b über unterschiedliche Linkerstrukturen mit den E3-Liganden VHL oder Pomalidomid konnte eine Reihe potenzieller HDAC6-PROTACs dargestellt werden. Eine Beurteilung auf den Abbau von HDAC6 erfolgte dabei über Western Blot und HiBiT-Proteinmarkierung.

Translation of the abstract (English)

The inhibition of HDAC6 has proven to be useful in the treatment of neurodegenerative diseases, autoimmune diseases, and tumour diseases, among others. Selective inhibition of HDAC6 is expected to reduce the off-target effect, which can lead to undesirable side effects. In addition, a precise investigation of the exact biological role and effects of HDAC6 is made very difficult by the inhibition of other isoforms. Starting with Tubastatin A, and the HDAC6 inhibitor Marbostat-100 derived from it, various derivatisations were carried out on the capping group to improve potency, selectivity and stability. By introducing different carbon substituents at the chiral center of Marbostat-100, hydrolysis of the dihydrouracil structure and subsequent decarboxylation were prevented. In the case of S-53b, this led to a more effective and significantly prolonged effect on tubulin acetylation compared to Marbostat-100, particularly in the cellular activity assay. A detailed understanding of the structural requirements of enzyme binding was developed from the synthesised compounds, which was underpinned by a crystal structure of the inhibitor S-53b with the second catalytic domain of Danio rerio HDCA6. The enantioselective synthesis of selected compounds showed that the orientation of the dihydrouracil ring plays a decisive role in the binding of the synthesised inhibitors to HDAC6. All target structures were evaluated for inhibitory activity and selectivity using a fluorometric activity assay on recombinant enzymes (HDAC1, 2, 3, 6 and 8). The most potent compounds were also analysed in a cellular activity assay by determining tubulin acetylation using western blotting. The resulting findings were then used to develop new HDAC6-PROTACs that can initiate the direct degradation of the target protein via the proteasome. By combining marbostat-100 or S-53b via different linker structures with the E3-ligands VHL or pomalidomide, a series of potential HDAC6-PROTACs could be presented. The impact on degradation of HDAC6 was assessed by western blotting and HiBiT protein tagging.

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