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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-586488
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.58648
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 18 July 2024 |
| Referee: | Prof. Dr. Diego F. Calvisi |
| Date of exam: | 8 July 2024 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Pathologie |
| Keywords: | Cholangiocarcinoma, Glutamine metabolism, YAP/TAZ |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 58648 |
Abstract (English)
To investigate the relationship between the development of cholangiocarcinoma and the activity of YAP1, WWTR1, and the effectors of glutamine metabolism, the expression of these mediators was compared in human tumor and healthy liver tissue, and the effect of silencing YAP1 and WWTR1 was examined. Examination of patient tissues revealed that all genes studied were significantly more expressed in ...
Abstract (English)
To investigate the relationship between the development of cholangiocarcinoma and the activity of YAP1, WWTR1, and the effectors of glutamine metabolism, the expression of these mediators was compared in human tumor and healthy liver tissue, and the effect of silencing YAP1 and WWTR1 was examined.
Examination of patient tissues revealed that all genes studied were significantly more expressed in tumor tissue than in healthy liver tissue, and this observation was also confirmed by immunohistochemistry.
The in vitro assays showed that the silencing of YAP1 and WWTR1 genes had a direct lowering effect on the gene and protein expression of the amino acid transporters SLC1A5, SLC7A5 and SLC38A1. The influence of WWTR1 and a combined silencing of YAP1 and WWTR1 was particularly strong. Concerning SLC7A5 and SLC38A1, YAP1 silencing was found to paradoxically increase their expression. GLS1, on the other hand, was found to be little to unaffected by transfection of YAP1 and WWTR1.
Looking at KKU-213 cells, silencing of YAP1 and WWTR1 had no effect on the amount of glutamate present, but glutamine was reduced following WWTR1 and YAP1/WWTR1 silencing. In RBE cells, suppression of YAP1 resulted in a decreased amount of glutamine, whereas glutamate decreased upon suppression of WWTR1 and YAP1/WWTR1.
Subsequently to these studies, cholangiocarcinoma cells were treated with the inhibitors V-9302 and Telaglenastat. The inhibitors were administered individually, and also in combination with each other and with 2-deoxyglucose.
Survival of HuCCT1 cells was reduced to about 50 % by 30 µM Telaglenastat, whereas treatment with V-9302 at 40 µM killed almost all cells. A combination of the two inhibitors did not significantly improve the treatment outcome of V-9302, with the addition of 2-deoxyglucose, zero percent survival could not be achieved at a lower concentration of V-9302. However, survival decreased more significantly at lower inhibitor levels than in the sole medication.
KKU-213 cells required only a concentration of 5 µM Telaglenastat to achieve 50 % survival, whereas V-9302 at 50 µM resulted in near complete cell killing. By combining both inhibitors, this could be achieved at 40 µM of each of the drugs, and a significantly better effect could already be achieved at smaller doses. The therapy could be further improved with the addition of 2-deoxyglucose.
In RBE cells, already 750 - 900 nM Telaglenastat was sufficient to reduce the survival rate to 50 %, while V-9302 showed a rapid effect with a complete killing of all cells at a concentration of 50 µM. Co-medication with Telaglenastat and V-9302 also significantly reduced tumor cell survival. Therapy with 0.6-0.8 µM Telaglenastat and 20-30 µM V-9302 allowed only about 50 % of cells to survive, while at concentrations of 1 µM Telaglenastat and 50 µM V-9302, no living cells could be detected. By adding 2-deoxyglucose, the required concentrations of the two drugs could be lowered again.
Finally, the relationship between YAP, TAZ, and the effectors of glutamine metabolism and the development of cholangiocarcinoma was also investigated in mice. In these experiments, it was found that the injection of AKT/YAP and AKT/TAZ did not affect the expression level of each other’s gene, but resulted in significantly stronger expression of Slc1a5, Slc7a5, Gls1, and Slc38a1. In addition, gene expression of Cyr61, the tumor growth factor studied here known to be a canonical Hippo target, was also greatly increased.
Immunohistochemistry showed significantly higher activity of each injected gene in tumor tissue than in the healthy liver tissue. In addition, the expression of the marker cytokeratin 19 was strongly increased in both AKT/YAP and AKT/TAZ mice, confirming the cholangiocellular features of these tumors. Looking at GLS1, AKT/YAP and AKT/TAZ mice showed a more pronounced immunoreactivity in the tumor tissue.
Overall, the data of this thesis demonstrate that induction of glutamine metabolism is a general feature of human iCCC. In addition, the Hippo effectors YAP and TAZ might be at least partly responsible for the induction of glutamine pathway members in this tumor type. Furthermore, expression levels of some members of this pathway might predict the prognosis of iCCC patients. Finally, inhibitors of the glutamine signaling showed some anti-growth effects in vitro, suggesting that targeting this metabolic cascade might be an innovative therapeutic strategy against this aggressive disease.
Translation of the abstract (German)
Um den Zusammenhang zwischen der Entstehung von Cholangiokarzinomen und der Aktivität von YAP1, WWTR1 und den Effektoren des Glutamin-Metabolismus zu untersuchen, wurde die Expression dieser Mediatoren in humanem Tumor- und gesunden Lebergewebe verglichen, sowie der Effekt eines Silencings von YAP1 und WWTR1 untersucht. Bei der Untersuchung der Patientengewebe konnte festgestellt werden, dass ...
Translation of the abstract (German)
Um den Zusammenhang zwischen der Entstehung von Cholangiokarzinomen und der Aktivität von YAP1, WWTR1 und den Effektoren des Glutamin-Metabolismus zu untersuchen, wurde die Expression dieser Mediatoren in humanem Tumor- und gesunden Lebergewebe verglichen, sowie der Effekt eines Silencings von YAP1 und WWTR1 untersucht.
Bei der Untersuchung der Patientengewebe konnte festgestellt werden, dass alle untersuchten Gene im Tumorgewebe deutlich stärker exprimiert waren als im gesunden Lebergewebe. Diese Beobachtung konnte auch in der Immunhistochemie bestätigt werden.
Die in vitro Tests zeigten, dass die im Silencing erniedrigte Expressionsstärke von YAP1 und WWTR1 einen direkten senkenden Einfluss auf die Gen- und Proteinexpression der Aminosäure Transporter SLC1A5, SLC7A5 und SLC38A1 hat. Besonders stark war die Beeinflussung durch WWTR1 und ein kombiniertes Silencing von YAP1 und WWTR1. Bei SLC7A5 und SLC38A1 konnte durch YAP1-Silencing eine gesteigerte Expression festgestellt werden. GLS1 hingegen konnte durch die Transfektion von YAP1 und WWTR1 nur kaum bis gar nicht beeinflusst werden.
KKU-213 Zellen betrachtend konnte festgestellt werden, dass das Silencing von YAP1 und WWTR1 keinen Einfluss auf die vorhandene Menge an Glutamat hatte, jedoch wurde Glutamin im WWTR1- und im YAP1/WWTR1-Silencing reduziert. In RBE Zellen führte die Suppression von YAP1 zu einer verminderten Menge an Glutamin, wobei Glutamat bei Suppression von WWTR1 und YAP1/WWTR1 sank.
Anschließend an diese Untersuchungen wurden Cholangiokarzinom-Zelllinien mit den Inhibitoren V-9302 und Telaglenastat behandelt. Die Inhibitoren wurden dabei einzeln, aber auch in Kombination miteinander und mit 2-Deoxyglucose verabreicht.
Die Überlebensrate von HuCCT1 Zellen konnte durch 30 µM Telaglenastat auf etwa 50 % gesenkt werden, wobei die Behandlung mit V-9302 bei 40 µM beinahe alle Zellen abtötete. Eine Kombination der beiden Inhibitoren konnte das Behandlungsergebnis von V-9302 nicht wesentlich verbessern, bei Zusatz von 2-Deoxyglucose konnte eine nullprozentige Überlebensrate zwar nicht bei einer geringeren Konzentration von V-9302 erreicht werden, allerdings sank das Überleben bei geringeren Inhibitormengen deutlicher als in der alleinigen Medikation.
KKU-213 Zellen benötigten nur eine Konzentration von 5 µM Telaglenastat um eine Überlebensrate von nur 50 % zu erreichen, wohingegen V-9302 bei 50 µM zu einem nahezu vollständigen Abtöten der Zellen führte. Durch Kombination beider Inhibitoren miteinander konnte dies bereits bei 40 µM von jedem der Medikamente erreicht werden und auch bei kleineren Dosierungen bereits ein deutlich besserer Effekt erzielt werden. Die Therapie konnte bei Zugabe von 2-Deoxyglucose nochmals verbessert werden.
Bei RBE Zellen reichten bereits 750 – 900 nM Telaglenastat um die Überlebensrate auf 50 % zu senken, V-9302 zeigte bei einer Konzentration von 50 µM einen rapiden Effekt mit einem vollständigen Abtöten aller Zellen. Auch durch Komedikation mit Telaglenastat und V-9302 konnte das Überleben der Tumorzellen deutlich eingeschränkt werden. Bei Therapie mit 0,6-0,8 µM Telaglenastat und 20-30 µM V-9302 konnten nur etwa 50% der Zellen überleben, bei 1 µM Telaglenastat und 50 µM V-9302 konnten keine lebenden Zellen mehr nachgewiesen werden. Durch Zugabe von 2-Deoxyglucose konnten die benötigten Konzentrationen der beiden Medikamente nochmals gesenkt werden.
Zum Schluss sollte der Zusammenhang zwischen YAP, TAZ und den Effektoren des Glutamin Metabolismus, sowie der Entwicklung eines Cholangiokarzinoms auch an Mäusen untersucht werden.
In den Versuchen konnte festgestellt werden, dass die Injektion von AKT/YAP und AKT/TAZ Überexpressionsvektoren zwar nicht die Expressionsstärke des jeweils anderen Gens beeinflussten, jedoch zu einer deutlich stärkeren Expression von Slc1a5, Slc7a5, Gls1 und Slc38a1 führten. Zudem war auch die Genexpression des hier untersuchten Tumorwachstungsfaktors Cyr61 stark erhöht.
In der Immunhistochemie zeigte sich im Tumorgewebe verglichen mit gesundem Lebergewebe eine deutlich höhere Aktivität des jeweils injizierten Gens. Zudem war sowohl bei AKT/YAP als auch bei AKT/TAZ Mäusen die Expression des Markers Zytokeratin 19 stark erhöht. GLS1 betrachtend konnte bei den AKT/YAP Mäusen kein Unterschied zwischen den Geweben festgestellt werden, wobei AKT/TAZ Mäuse im Tumorgewebe eine stärkere Färbung zeigten.
Metadata last modified: 18 Jul 2024 08:00
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