Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy has shown extraordinary success in the treatment of B cell leukemia and lymphoma. For treatment of solid cancers, CAR T cell therapy faces many obstacles. Most prominent, the inhibitory tumor microenvironment limits the CAR T cell endurance, and the abundance of cancer cells leads to T cell exhaustion. T cell states have been studied to identify populations with best fitness and long-lasting effector functions. The modulation of immune checkpoint molecules, most prominent PD1, enhances the anti-tumor performance of T cells, at least transiently. Ongoing effort is made to identify further players in the orchestration of CAR T cell functionality. Our colleagues analyzed tumor infiltrating lymphocytes (TILs) of various solid tumor entities and found the gene activity of VCAM1 (vascular adhesion molecule 1) upregulated in terminal exhausted TILs. So far, VCAM1 is commonly known to be expressed on activated endothelium and to bind VLA-4 on lymphocytes to mediate their adherence and transmigration, however the expression of VCAM1 on T cells was barely reported. We aimed at defining whether VCAM1 is also expressed on CAR T cells and how VCAM1 modulates CAR T cell function. We found that VCAM1 is indeed upregulated, predominantly on CD8+ CAR T cells, upon activation by either TCR or CAR. Interestingly VCAM1 expression was barely induced on CD4+ CAR T cells or on T cells without CAR. VCAM1 induction was the strongest by the 4-1BB CAR, less by the CD28 CAR. CAR signaling is required to induce early VCAM1 expression since deletion of CAR signaling domains abolished the VCAM1 induction. To address the impact of CAR T cell associated VCAM1 on target cell recognition, we took advantage of BXPC-3 cells that express the VCAM1 ligand VLA-4 but lack VCAM1 expression. We analyzed CAR T cells with CRISPR/Cas9 mediated VCAM1 knockout in co-culture with BXPC-3 cells and found CAR T cells with VCAM1 knockout showed much lower expression of the activation markers CD25 and CD69. Also, the exhaustion molecules PD1, Tim3 and Lag3 were expressed to lower levels on VCAM1 knockout CAR T cells. The VCAM1 knockout in CAR T cells was leading to enrichment of the effector memory phenotype. Markers for degranulation CD107a and intracellular granzyme B and perforin levels were likewise reduced in VCAM1 knockout CAR T cells. However, the in vitro cytotoxicity towards BXPC-3 cells was not altered. We further found reduced avidity of VCAM1 knockout CAR T cells to the target cells compared to the CRISPR-control. These data imply that VCAM1 takes part in the CAR T cell – tumor cell interaction. Our conclusion was sustained by the microscopy observation that CAR and VCAM1 co-localize on the same spot on the T cells and in the contact region to the target cell. With that we conclude that VCAM1, expressed by CAR T cells, amplifies the avidity in their contact with tumor cells and impacts the activation and exhaustion development of the CAR T cells.

Die Therapie mit chimären Antigenrezeptor (CAR) T Zellen hat außergewöhnliche Erfolge bei der Behandlung von B Zell Leukämie und Lymphom gezeigt. Bei der Behandlung solider Tumoren stößt die CAR T Zell-Therapie jedoch auf viele Hindernisse. Laufende Bemühungen zielen darauf ab, Akteure in der Orchestrierung der CAR T Zell Funktionalität zu identifizieren. Unsere Kollegen analysierten Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TILs) verschiedener solider Tumorentitäten und fanden heraus, dass die Genaktivität von VCAM1 (Vaskuläres Adhäsionsmolekül 1) in terminal erschöpften TILs hochreguliert ist. Bisher ist bekannt, dass VCAM1 auf aktivierten Endothelzellen exprimiert wird und an VLA-4 auf Lymphozyten bindet, um deren Adhärenz und Transmigration zu vermitteln, jedoch wurde die Expression von VCAM1 auf T-Zellen kaum berichtet.
Wir wollten feststellen, ob VCAM1 auch auf CAR T Zellen exprimiert wird und wie VCAM1 die Funktion von CAR-T-Zellen modifiziert.
Wir fanden heraus, dass VCAM1 tatsächlich überwiegend auf CD8+ CAR T Zellen nach Aktivierung durch entweder TCR oder CAR hochreguliert ist. Interessanterweise wurde die VCAM1-Expression auf CD4+ CAR T Zellen oder auf T Zellen ohne CAR kaum induziert. Die VCAM1 Induktion war bei 4-1BB CAR T Zellen am stärksten, weniger bei CD28 CAR T Zellen. die Deletion einzelner CAR Signaldomänen hat die VCAM1 expression verringert oder sogar aufgehoben. Um den Einfluss von CAR T Zell assoziiertem VCAM1 auf die Zielzellerkennung zu untersuchen, nutzten wir BXPC-3-Zellen, die den Liganden VLA-4 exprimieren, aber keine VCAM1-Expression aufweisen. Wir analysierten CAR T Zellen mit CRISPR/Cas9 vermitteltem VCAM1 Knockout in Kokultur mit BXPC-3 Zellen und fanden heraus, dass CAR T Zellen mit VCAM1 Knockout eine viel geringere Expression der Aktivierungsmarker CD25 und CD69 zeigten. Auch die Erschöpfungsmoleküle PD1, Tim3 und Lag3 waren auf VCAM1 Knockout CAR T Zellen niedriger exprimiert. Der VCAM1 Knockout in CAR-T-Zellen führte zu einer Anreicherung des Effektor Gedächtnis Phänotyps. Marker für die Degranulation CD107a und intrazelluläres Granzyme B und Perforin waren ebenfalls in VCAM1 Knockout CAR T Zellen reduziert. Die Zytotoxizität gegenüber BXPC-3-Zellen in vitro war jedoch nicht verändert. Wir fanden eine reduzierte Avidität von VCAM1 Knockout CAR T Zellen zu den Zielzellen im Vergleich zur CRISPR Kontrolle. Diese Daten implizieren, dass VCAM1 an der Interaktion zwischen CAR T Zellen und Tumorzellen beteiligt ist. Unsere Schlussfolgerung wurde durch die mikroskopische Beobachtung gestützt, dass CAR und VCAM1 an derselben Stelle auf den T-Zellen und im Kontaktbereich zur Zielzelle ko-lokalisieren. Wir schließen daraus, dass VCAM1, exprimiert von CAR-T-Zellen, die Avidität in ihrem Kontakt mit Tumorzellen verstärkt und die Aktivierung sowie Erschöpfungsentwicklung der CAR T Zellen beeinflusst.