Aberrant DNA methylation in primary breast cancer tumors plays an important role in gene regulation and transcriptome diversity and influences metastatic behavior. Despite multiple hypotheses on how malignant cells spread and become metastatic, there is a lack of comprehensive analysis of how the methylome contributes to the process of dissemination. Previous studies have shown that metastatic cells accumulate hypermethylation at promoters and demethylation events in intra- and intergenic regions. These epigenetic changes contribute to increased chromosomal instability and the downregulation of tumor suppressor genes. Furthermore, analysis conducted by our laboratory has revealed the presence of epigenetic modifications in metastasis, indicating distinct recurrent patterns of promoter methylation and demethylation. However, it is unclear whether these epigenetic changes arise as side effects of cell aging and increased proliferation or through the acquisition of epigenetic alterations by single cells in early primary tumor lesions, which are then selected to become metastatic. To address this complex issue, a novel approach to analyze diverse methylation patterns throughout primary tumor progression was developed, which is the topic of this thesis. Specifically, a barcoded bisulfite amplicon deep sequencing (BBA-seq) technique was used to characterize the methylome on a single allelic level within breast cancer in the Her2-driven Balb-NeuT mouse model. Computational processing, clustering, and precise representation of the sequenced reads according to their methylation composition led to a clear resolution of the methylome in seven primary tumors and their corresponding metastases within 9 DNA regions. These regions include demethylation, hypermethylation, and intermediate conditions of DNA methylation. The findings revealed diverse methylation patterns, ranging from a constant increase in DNA methylation to the identification of sub-clones with an already high methylation character within primary tumors. These observations highlight the complexity and variability of methylation patterns during tumor progression. The results suggest that further investigation into the role of these sub-clones is critical in understanding how epigenetic changes drive metastasis. In addition to identifying and characterizing DNA methylation patterns, a comprehensive protocol was established to alter the DNA methylome via a gene knockdown of the de-novo DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3a using a CRISPR/Cas9 nickase approach in hard-to-transfect primary mouse mammary gland cells. Overall, this thesis comprehensively analyzes DNA methylome remodeling during primary tumor progression and metastasis in breast cancer. The novel methodology developed in this study may also be applied to investigate other research questions related to DNA methylation in cancer biology and beyond.

Anormale DNA-Methylierung in primären Brusttumoren spielt eine entscheidende Rolle bei der Genregulation, der Vielfalt des Transkriptoms und beeinflusst das metastatische Verhalten. Trotz zahlreicher Hypothesen darüber wie maligne Zellen sich ausbreiten und metastasieren, fehlen umfassende Analysen wie das Methylom zum Prozess der Dissemination beiträgt. Frühere Studien haben gezeigt, dass Metastasen Hypermethylierung in Promotoren und Demethylierungsereignisse in intra- und intergenen Regionen akkumulieren. Diese epigenetischen Veränderungen tragen zur erhöhten chromosomalen Instabilität und zur Hemmung von Tumorsuppressorgenen bei. Darüber hinaus hat eine vorhergehende Studie unseres Labors das Vorhandensein epigenetischer Modifikationen in Metastasen aufgezeigt, welche wiederkehrende Muster von Promotor-Methylierung und Demethylierung aufweisen. Es ist jedoch unklar, ob diese epigenetischen Veränderungen als Nebenprodukte der Zellalterung und erhöhten Proliferation entstehen oder ob einzelne Zellen im Primärtumor steigende DNA Methylierung akkumulieren, was zu einem Vorteil im Metastasierungsprozess führen könnte. Um dieses komplexe Problem zu adressieren, wurde in dieser Arbeit ein neuartiger Ansatz zur Analyse diverser Methylierungsmuster im Verlauf der primären Tumorprogression entwickelt. Dabei wurde eine barcodierte Bisulfit-Amplicon-Sequenzierungstechnik genutzt, um das Methylom auf Einzel-Allel-Ebene im Her2-getriebenen Balb-NeuT-Maus-Brustkrebsmodell zu charakterisieren. Durch computergestützte Verarbeitung, Clusterbildung und präzise Darstellung der sequenzierten DNA-Fragmente anhand ihrer Methylierungszusammensetzung konnte das Methylom von sieben primären Tumoren und gepaarten Metastasen in neun DNA-Regionen klar aufgelöst werden. Diese Regionen umfassen Demethylierung, Hypermethylierung und intermediäre Zustände der DNA-Methylierung. Die Ergebnisse zeigten vielfältige Methylierungsmuster, die von einem kontinuierlichen Anstieg der DNA-Methylierung bis zur Identifikation von Subklonen mit bereits hohem Methylierungscharakter innerhalb der primären Tumoren reichten. Diese Beobachtungen unterstreichen die Komplexität und Variabilität der Methylierungsmuster während der Tumorprogression. Die Resultate legen nahe, dass eine genauere Untersuchung dieser Subklone wichtig ist, um zu klären, ob und wie anormale DNA-Methylierung die Metastasierung antreibt. Neben der Identifikation und Charakterisierung von DNA-Methylierungsmustern wurde in dieser Arbeit ein Protokoll entwickelt, um die Zusammensetzung des DNA-Methyloms durch Gen-Knockdown der de-novo DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3a mithilfe eines CRISPR/Cas9-Nickase-Ansatzes in schwer zu transfizierenden primären Maus-Brustdrüsenzellen zu verändern. Insgesamt analysiert diese Arbeit die Umgestaltung des DNA-Methyloms während der primären Tumorprogression und Metastasierung bei Brustkrebs umfassend. Die in dieser Studie entwickelte neuartige Methodologie kann auch auf andere Forschungsfragen im Zusammenhang mit der DNA-Methylierung in der Krebsbiologie und darüber hinaus angewendet werden.