Metastatic spread of individual tumor cells from the primary tumor often occurs early in breast cancer progression. The presence of disseminated cancer cells (DCCs) in the bone marrow is a strong indicator of an increased risk for developing bone and visceral metastases in breast cancer patients. Due to the rarity of DCCs, bone marrow samples are often prepared at high cellular density to maximize the chances of detection. In this thesis, we aimed to first develop a method for identification and isolation of such very rare cells from these densely packed cells. Additionally, we developed a novel genome and proteome (G&P) analysis workflow, which allows for comprehensive analysis of single-cell DNA and targeted profiling of proteins expression within individual cells. The optimized protocol for isolating bone marrow DCCs, incorporated immunofluorescence staining for tumor cell identification, combined with AP-polymer staining to counteract laser-induced damage, followed by laser-assisted ablation of surrounding cells, manual micromanipulation of the target cells, whole genome amplification, quality control, and low-coverage sequencing to analyze copy number alterations. The protocol was validated on cytospins prepared with MCF-7 cells spiked in blood mononuclear cells before application to archived bone marrow DCCs from DCIS patients. We then screened four frozen archived bone marrow cytospins of DCIS patients treated at the University hospital in Tübingen. We successfully isolated DCCs from archived bone marrow cytospins in one out of four DCIS patients, enabling subsequent CNV analysis which revealed genomic instability with heterogeneous alterations across DCCs and a balanced genomic profile for normal cell, further approving the reliability of the method. Additionally, we developed the G&P workflow which utilizes antibodies conjugated with DNA oligonucleotides designed to enable their amplification alongside the single-cell genome facilitating parallel genome and proteome profiling by quantitative PCR. As a proof of concept, we demonstrated the method’s capability by quantifying the copy number of the ERBB2 gene alongside protein expression levels of HER2 and phospho-HER2 in single cells. The method was further validated by assessing cellular and molecular responses at the single-cell level to lapatinib treatment, monitoring HER2 pathway activation. Furthermore, we applied the method to analyze critical signaling pathways involved in breast cancer progression. Specifically, we focused on HER2 and key downstream signaling markers including phospho-HER2, phospho-ERK1/2, phospho-AKT, and phospho-STAT3. Signaling pathway analysis was first validated using cell lines (MDA-MB-231, MDA-MB-468, and BT474), revealing heterogeneity across different breast cancer subtypes and the interplay between existing molecular alterations and activated signaling pathways. Finally, we showcased the application of the method in a clinical context, analyzing bone marrow samples of a HER2-positive breast cancer patient, further demonstrating its potential to investigate the heterogeneity of DCCs and mechanisms of drug resistance. To conclude, we established a method for isolating bone marrow-derived DCCs from high-density cytospins, with improved reliability and efficiency compared to traditional techniques and the G&P workflow. Together, the methods will enable unprecedented multiomics analyses of DCC even from of archived BM samples.

Die metastatische Ausbreitung einzelner Tumorzellen aus dem Primärtumor erfolgt oft schon in einem frühen Stadium der Brustkrebsentwicklung. Das Vorhandensein von disseminierten Krebszellen (DCCs) im Knochenmark bei Brustkrebspatientinnen ist ein starker Indikator für ein erhöhtes Risiko Knochen- und viszerale Metastasen zu entwickeln. Aufgrund der Seltenheit von DCCs werden Knochenmarkproben oft mit einer hohen Zelldichte präpariert, um die Chancen auf einen Nachweis zu erhöhen. In dieser Arbeit wurde zunächst eine Methode zur Identifizierung und Isolierung dieser sehr seltenen Zellen aus diesen Knochenmarkproben entwickelt. Darüber hinaus wurde ein neuartiger Arbeitsablauf für die Genom- und Proteomanalyse (G&P) entwickelt, der eine umfassende Analyse der Einzelzell-DNA und die gezielte Erstellung von Profilen der Proteinexpression in einzelnen Zellen ermöglicht. Das optimierte Protokoll zur Isolierung von DCCs aus Knochenmark umfasste eine Immunfluoreszenzfärbung zur Identifizierung von Tumorzellen in Kombination mit einer AP-Polymerfärbung, um laserinduzierten Schäden entgegenzuwirken. Darauf folgte eine lasergestützte Ablation der umgebenden Zellen, eine manuelle Mikromanipulation der Zielzellen, eine Ganzgenom-Amplifikation, eine Qualitätskontrolle und eine Low-Coverage-Sequenzierung zur Analyse von Kopienzahlveränderungen. Das Protokoll wurde an mit MCF-7-Zellen in mononukleären Blutzellen präparierten Zytospins validiert, bevor es auf archivierte DCCs aus dem Knochenmark von DCIS-Patienten angewendet wurde. Anschließend wurden vier gefrorene archivierte Knochenmark-Zytospins von DCIS-Patientinnen untersucht, die an der Universitätsklinik Tübingen behandelt wurden. Bei einem von vier DCIS-Patientinnen konnten wir erfolgreich DCCs aus archivierten Knochenmarkzytospins isolieren, was eine anschließende CNV-Analyse ermöglichte. Diese ergab eine genomische Instabilität mit heterogenen Veränderungen bei DCCs und ein ausgewogenes genomisches Profil bei normalen Zellen, welches die Zuverlässigkeit der Methode weiter bestätigte.
Darüber hinaus wurde der G&P-Arbeitsablauf entwickelt. Dabei wurden Antikörper verwendet, die mit spezifischen DNA-Oligonukleotiden konjugiert sind, sodass Einzelzellgenome amplifiziert werden können. Dies ermöglichte eine parallele Erstellung von Genom- und Proteomprofilen durch quantitative PCR. Die Leistungsfähigkeit der Methode wurde durch die Quantifizierung der Kopienzahl des ERBB2-Gens sowie der Proteinexpression von HER2 und Phospho-HER2 in Einzelzellen nachgewiesen. Weiterhin wurde diese validiert, indem die zellulären und molekularen Reaktionen auf eine Lapatinib-Behandlung auf Einzelzellebene bewertet und die Aktivierung des HER2-Signalwegs überwacht wurde. Darüber hinaus wurde die Methode angewandt, um kritische Signalwege zu analysieren, die an der Progression von Brustkrebs beteiligt sind. Insbesondere HER2 und wichtige nachgeschaltete Signalmarker wie phospho-HER2, phospho-ERK1/2, phospho-AKT und phospho-STAT3 standen im Fokus der Untersuchung. Die Analyse der Signalwege wurde zunächst anhand von Zelllinien (MDA-MB-231, MDA-MB-468 und BT474) validiert, wobei die Heterogenität der verschiedenen Brustkrebs-Subtypen und das Zusammenspiel zwischen vorhandenen molekularen Veränderungen und aktivierten Signalwegen deutlich wurde. Schließlich wurde die Anwendung der Methode in einem klinischen Kontext angewandt, indem Knochenmarkproben einer HER2-positiven Brustkrebspatientin analysiert und damit das Potenzial zur Untersuchung der Heterogenität von DCCs und der Mechanismen der Medikamentenresistenz weiter unter Beweis gestellte wurden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit eine Methode zur Isolierung von DCCs aus dem Knochenmark aus Zytospins mit hoher Dichte entwickelt wurde, die im Vergleich zu herkömmlichen Techniken und dem G&P-Arbeitsablauf zuverlässiger und effizienter ist. Zusammen werden die Methoden beispiellose Multiomics-Analysen von DCCs selbst aus archivierten Knochenmarkproben ermöglichen.