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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-773624
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.77362
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 21 July 2025 |
| Referee: | Pro. Dr. Ralf Wagner |
| Date of exam: | 8 July 2025 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
| Keywords: | HERV-H, endogene Retroviren |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 77362 |
Abstract (English)
Human endogenous retroviruses (HERV) are retroviral fossils encoded within the human genome. They constitute for about 8 % of all sequences in the genome, and even though most HERV elements are highly depleted and inactive, HERV re-activation has been repeatedly associated with the development and progression of different kinds of cancer. Especially enhanced transcription and overexpression of ...
Abstract (English)
Human endogenous retroviruses (HERV) are retroviral fossils encoded within the human genome. They constitute for about 8 % of all sequences in the genome, and even though most HERV elements are highly depleted and inactive, HERV re-activation has been repeatedly associated with the development and progression of different kinds of cancer. Especially
enhanced transcription and overexpression of their envelope proteins (env) has been observed in tumor tissues and human tumor cell lines, making HERV env an interesting new target for cancer immunotherapy.
Env protein sequences of 5 HERV families, namely HERV-W, -FRD, -H, -K and ERV3.1 have been characterized for their protein expression properties and showed stable expression for all proteins. Except for ERV3.1 and HERV-W, modifications within the signal peptide and transmembrane-anchored domain including the cytoplasmic tail did not affect protein expression levels. Furthermore, cell-cell fusion activity was observed for HERV-FRD and HERVW,
which could be abolished for HERV-FRD by introducing mutations knocking out specific Nglycosylation sites previously described in the literature. Therefore, protein expressing env sequences could be provided for further vaccination strategies to our cooperation partners for all HERV families tested. Within this thesis, all the following work was solely focused on HERV-H, the most abundant HERV family in the human genome.
In the second part of this work, a suite of env-based antigens from the HERV-H family was designed as membrane-anchored and soluble proteins. Therefore, modifications of the transmembrane- and the putative immunosuppressive domain were introduced to the env protein. The antigens were administered to BALB/c mice in either a heterologous DNA-prime, protein-boost, or a homologous protein prime-boost regimen to assess their immunogenic
properties. All env variants elicited specific antibody responses and almost no differences were seen between the groups. An effect of the ISD, or a presumably inactivating mutation thereof, on the humoral immune response could not be observed in the mouse model.
Overall, it could be demonstrated that the HERV-H env protein is a suitable antigen that induces a strong, specific humoral response in mice.
Furthermore, while it was not possible to generate HERV-H env specific monoclonal antibodies (mAbs) via the hybridoma approach, polyclonal antibodies (pAbs) purified from immunizedrabbits were able to specifically recognize the env protein in ELISA, western blot and immunocytochemistry (ICC) assays.
The last part of this thesis was dedicated to establishing diagnostic tools screening human tumor cells for HERV-H env transcription and expression. RT-PCR and RT-qPCR assays could detect an approximately 600-bp fragment of the env 3’ part in all human cell lines tested.
Furthermore, the combination of western blot and an ICC assay with formalin-fixed paraffinembedded (FFPE) human tumor cell lines could prove HERV-H env protein expression to some extent. However, all assays showed limitations regarding the proof of actual cell-surface protein expression. A sequencing approach from isolated genomic DNA of selected cell lines showed, that at least one of the cell lines (MCF-7) had the genetic potential to express a complete full-length env protein. However, the overall ratio of incomplete-to-complete env sequences was very high. Additionally, treatment with the proteasome-inhibitor Bortezomib led to enhanced HERV-H env protein levels, suggesting that most env proteins get degraded after expression, presumably due to incorrect folding.
The established ICC assay was further applied to tumorous and normal colorectal tissues to show HERV-H env protein expression in colorectal cancer (CRC) tissue, but the results remained inconclusive.
Overall, these data demonstrate that while there is strong evidence of HERV-H env transcription and expression in tumor cells on both mRNA and protein levels, it remains unclear if these proteins are structural integer and presented on the cell surface of tumor tissue, which would be a prerequisite for an antibody-based cancer immunotherapy targeting cell-surface displayed HERV-H env.
Translation of the abstract (German)
kodiert sind. Sie machen etwa 8 % aller Sequenzen im Genom aus, und obwohl die meisten HERV-Elemente stark verändert und inaktiv sind, wurde die Reaktivierung von HERV wiederholt mit der Entstehung und dem Fortschreiten verschiedener Krebsarten in Verbindung gebracht. Insbesondere eine verstärkte Transkription und Überexpression ihrer Hüllproteine (env) wurde in Tumorgeweben und menschlichen ...
Translation of the abstract (German)
kodiert sind. Sie machen etwa 8 % aller Sequenzen im Genom aus, und obwohl die meisten HERV-Elemente stark verändert und inaktiv sind, wurde die Reaktivierung von HERV wiederholt mit der Entstehung und dem Fortschreiten verschiedener Krebsarten in Verbindung gebracht. Insbesondere eine verstärkte Transkription und Überexpression ihrer Hüllproteine (env) wurde in Tumorgeweben und menschlichen Tumorzelllinien beobachtet,
was HERV-env zu einem interessanten neuen Ziel für die Krebsimmuntherapie macht. Env-Proteinsequenzen von 5 HERV-Familien, nämlich HERV-W, -FRD, -H, -K und ERV3.1, wurden hinsichtlich ihrer Proteinexpressionseigenschaften charakterisiert und zeigten eine stabile Expression für alle Proteine. Mit Ausnahme von ERV3.1 und HERV-W hatten Modifikationen innerhalb des Signalpeptids und der transmembranverankerten Domäne einschließlich des zytoplasmatischen Schwanzes keinen Einfluss auf die Proteinexpressionsniveaus. Darüber hinaus wurde für HERV-FRD und HERV-W eine Zell-Zell-Fusionsaktivität beobachtet, die für HERV-FRD durch die Einführung von Mutationen, die bestimmte in der Literatur beschriebene N-Glykosylierungsstellen ausschalten, aufgehoben werden konnte. Daher konnten unseren Kooperationspartnern für alle getesteten HERVFamilien Protein-exprimierende env-Sequenzen für weitere Impfstrategien zur Verfügung
gestellt werden. Im Rahmen dieser Arbeit konzentrierten sich alle folgenden Arbeiten ausschließlich auf HERV-H, die im menschlichen Genom am häufigsten vorkommende HERVFamilie.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Reihe env-basierter Antigene aus der HERV-H-Familie als membranverankerte und lösliche Proteine entwickelt. Dafür wurden Modifikationen der transmembran- und der vermeintlich immunsuppressiven Domäne in das env-Protein eingeführt. Die Antigene wurden BALB/c-Mäusen entweder in einem heterologen DNA-Prime-
Protein-Boost- oder einem homologen Protein-Prime-Boost-Schema verabreicht, um ihre immunogenen Eigenschaften zu beurteilen. Alle env-Varianten lösten spezifische Antikörperreaktionen aus und es wurden fast keine Unterschiede zwischen den Gruppen festgestellt. Eine Auswirkung der ISD oder einer vermutlich inaktivierenden Mutation davon auf die humorale Immunreaktion konnte im Mausmodell nicht beobachtet werden. Insgesamtkonnte gezeigt werden, dass das HERV-H-env-Protein ein geeignetes Antigen ist, das bei Mäusen eine starke, spezifische humorale Reaktion hervorruft.
Während es nicht möglich war, HERV-H-env-spezifische monoklonale Antikörper (mAbs) über den Hybridomansatz zu erzeugen, konnten polyklonale Antikörper (pAbs), die aus immunisierten Kaninchen isoliert wurden, das env-Protein in ELISA-, Western Blot- und Immunzytochemie-(ICC)-Tests spezifisch erkennen.
Der letzte Teil dieser Arbeit widmete sich der Entwicklung diagnostischer Plattformen zum Screening menschlicher Tumorzellen auf HERV-H-env-Transkription und -Expression. RT-PCRund RT-qPCR-Tests konnten in allen getesteten menschlichen Zelllinien ein etwa 600-bp-Fragment des env-3’-Teils nachweisen. Darüber hinaus konnte die Kombination aus Western Blot und einem ICC-Test mit Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) menschlichen Tumorzelllinien die Expression des HERV-H-env-Proteins bis zu einem gewissen Grad nachweisen. Alle Tests zeigten jedoch Einschränkungen hinsichtlich des Nachweises der tatsächlichen Expression von Zelloberflächenproteinen. Ein Sequenzierungsansatz aus
isolierter genomischer DNA ausgewählter Zelllinien zeigte, dass mindestens eine der Zelllinien (MCF-7) das genetische Potenzial hatte, ein vollständiges env-Protein in voller Länge zu exprimieren. Das Gesamtverhältnis unvollständiger zu vollständigen env-Sequenzen war jedoch sehr hoch. Darüber hinaus führte die Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor
Bortezomib zu erhöhten HERV-H-env-Proteinspiegeln, was darauf hindeutet, dass die meisten env-Proteine nach der Expression abgebaut werden, vermutlich aufgrund falscher Faltung.
Der etablierte ICC-Test wurde außerdem auf tumoröses und normales kolorektales Gewebe angewendet, um die Expression des HERV-H-env-Proteins in kolorektalem Krebsgewebe (CRC) nachzuweisen. Die Ergebnisse blieben jedoch unschlüssig.
Insgesamt zeigen diese Daten, dass es zwar starke Hinweise auf die Transkription und Expression von HERV-H-env in Tumorzellen sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene gibt, es jedoch unklar bleibt, ob diese Proteine strukturell intakt sind und auf der Zelloberfläche des Tumorgewebes vorhanden sind, was eine Voraussetzung für eine antikörperbasierte Krebsimmuntherapie wäre, die auf ein auf der Zelloberfläche vorhandenes HERV-H-env abzielt.
Metadata last modified: 21 Jul 2025 06:46
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