In the following, the development of a liposome-based complement assay platform was investigated with the aim to improve upon traditional hemolysis assays used in complement diagnostics and research. The complement system is a fundamental part of innate immunity and plays a critical role in pathogen defense, inflammation, and immune regulation. While traditional assays generally have enabled the study of complement activation, they fall short in providing pathway-specific and functional lysis-based insights for all three activation pathways. The research in this thesis aimed to provide an assay which is capable of pathway specific readouts for all three complement pathways and an easier to perform, more reproducible and standardizable alternative to the established hemolysis assay and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Inspired by the idea of a multiplexed assay for all pathways, encapsulation of three fluorophores and their influence on the lipid bilayer and the biological reactivity, i.e. on the complement system, were investigated. Once the feasibility of their simultaneous detection had been confirmed, the fluorophores IR-783, sulforhodamine B (SRB), and 1,3,6,8-pyrenetetrasulfonic acid (PTSA) were encapsulated. Spectroscopic and small-angle X-ray scattering (SAXS) analyses, together with subsequent liposome-based complement assay measurements revealed distinct behaviors for each dye. IR-783 exhibited strong interactions with the lipid bilayer. SAXS data showed that IR-783 significantly altered the bilayer’s electron density, suggesting the integration of IR 783 into the lipid bilayer. This interaction prevented liposome formation in low cholesterol formulations and required extensive purification for high cholesterol formulations. This indicates its profound impact on the membrane structure. For SRB, SAXS analysis indicated fluorophore adsorption onto the bilayer without significantly altering its internal structure. In contrast to both other dyes, PTSA showed minimal interaction with the lipid bilayer. SAXS and dialysis experiments confirmed that PTSA remained confined to the aqueous solutions and could be removed completely from the liposome exterior. Subsequent analysis of the liposomes in the complement assay revealed altered complement activation patterns when IR-783 and PTSA were entrapped in comparison to the established SRB encapsulating liposomes. In both cases, decreased complement-induced lysis was obtained for the liposomes investigated (including low and high cholesterol content and antibody or lipopolysaccharide (LPS) modification) compared to the respective SRB encapsulating equivalents. These findings emphasize the importance of considering encapsulant effects in the design of liposomes which are applied in biological systems. The altered complement activation for each fluorophore furthermore restricted the subsequent development of a multiplexed liposome based pathway specific complement assay.
Building on this understanding, the aim of developing a platform for complement pathway specific analysis was still pursuit. Mannan functionalized liposomes (Man-Liposomes) which specifically activated the lectin pathway were achieved through careful optimization of mannan amination chemistry and coupling conditions. These liposomes were shown to trigger complement-mediated lysis via mannose binding lectin (MBL). A panel of inhibitors targeting the complement proteins C1q, C1s, MBL, MASP-2, Factor B, and C5 was used to confirm their specificity. Subsequent analysis demonstrated long-term stability of the Man-Liposomes. Additionally, validation on a cohort of 97 healthy human serum samples showed strong correlation with ELISA-based C3b deposition assays (Pearson’s r = 0.77). The platform was then further extended to also assess the classical and alternative pathways specifically. For the classical pathway, two liposome designs were evaluated: antibody modified liposomes and liposomes with high cholesterol content (hiChol-Liposomes). Liposomes functionalized with biotin and subsequently bound anti-biotin antibodies reliably triggered specific classical pathway activation, which was confirmed by inhibitor studies. HiChol Liposomes were investigated as a simpler alternative to antibody modification. For those, specific classical pathway activation was also confirmed. However, hiChol-Liposome lysis revealed no correlation to the ELISA-based C3b deposition assay, suggesting that cholesterol mediated activation may involve additional factors compared to the antibody triggered control assay. For the alternative pathway, liposomes were modified with LPS and specificity was confirmed under Mg²⁺/EGTA conditions, which were used to suppress classical and lectin pathway activity. However, a significant number of serum samples failed to induce LPS Liposome lysis despite showing activation in the ELISA. This highlights the need for further optimization of liposome surface chemistry or for LPS trigger substitutes for reliable alternative pathway readouts in the future.
Fundamental studies investigating the potential applicability of plasma as an alternative to human serum in the future demonstrated the assay’s versatility. EDTA- and citrate-treated serum, once replenished with calcium and magnesium ions, restored complement activity. ETDA-treated serum was determined to be better suited for this assay with 90 % recovery of untreated serum as reference compared to citrate serum with 71 % recovery. The application of citrate serum was limited in this assay due to liposome destabilization, assumed to be caused by too high ion concentrations which were required due to its weaker chelation efficiency. The assay was further tested with animal sera, revealing species-specific differences in complement reactivity. While murine serum exhibited no liposome lysis, porcine and rat sera induced complement-mediated lysis depending on the liposomes used. Contrary to human serum, porcine serum lysed low cholesterol liposomes more effectively than high-cholesterol ones. Further experiments with pegylated liposomes of varying cholesterol content revealed a dose dependent response, peaking at 20 %mol. cholesterol. Reactivity across all investigated rat strains was similar with moderate lysis of low cholesterol liposomes and slightly higher lysis levels of high cholesterol formulations. LPS-modified liposomes exhibited further enhanced lysis while pegylated liposomes remained stable unless modified with antibodies. In summary, while further refinement in liposome surface chemistry optimization and correlation studies will be essential to fully realize this assays potential, this liposome-based assay platform offers a powerful and versatile approach for functional pathway specific complement analysis in diagnostics, therapeutic monitoring, and fundamental research.

Im Folgenden wurde die Entwicklung einer liposomen-basierten Komplement Assay Plattform mit dem Ziel untersucht, traditionelle Hämolyse-Assays, die in der Komplementdiagnostik und -forschung verwendet werden, zu verbessern. Das Komplementsystem spielt als elementarer Teil der angeborenen Immunität eine entscheidende Rolle bei der Abwehr von Krankheitserregern, bei Entzündungen und bei der Immunregulation. Im Allgemeinen haben herkömmliche Assays zwar die Untersuchung der Komplementaktivität ermöglicht, bieten jedoch nicht für alle drei Aktivierungswege eine pfadspezifische und funktionelle, auf Lyse basierende Analysemöglichkeit. Die Forschung dieser Arbeit zielte darauf ab diese Lücke durch eine funktionelle liposomenlyse-basierte Alternative zu den etablierten Hämolyse und ELISA-Assays zu schließen, die einfacher durchzuführend, besser reproduzierbar und standardisierbar ist. Ziel war es alle drei Komplementaktivierungswege spezifisch auszulesen zu können.
Inspiriert von der Idee eines Multiplex-Assays für alle Komplementwege wurde zu Beginn die Verkapselung von drei Fluorophoren und deren Einfluss auf die Lipidmembran und auf die biologische Reaktivität anhand des Komplementsystems untersucht. Nachdem die Möglichkeit des simultanen Nachweises der drei Fluorophore bestätigt war, wurden die Farbstoffe IR-783, Sulforhodamin B (SRB) und 1,3,6,8 Pyrentetrasulfonsäure (PTSA) in Liposomen eingekapselt. Spektroskopische und Kleinwinkel Röntgenstreuungsanalysen (SAXS) sowie anschließende liposomen-basierte Komplement Assay-Messungen ergaben für jeden Farbstoff unterschiedliche Verhaltensweisen. IR-783 wies starke Wechselwirkungen mit der Lipiddoppelschicht auf. SAXS-Daten zeigten, dass IR-783 die Elektronendichte der Doppelschicht erheblich beeinflusste, was auf eine Integration des Farbstoffs in die Lipidmembran schließen lässt. Diese Wechselwirkung verhinderte die Liposomenbildung bei Formulierungen mit niedrigem Cholesteringehalt und erforderte eine umfassende Abtrennung des überschüssigen Farbstoffs bei Formulierungen mit hohem Cholesteringehalt. Dies weist ebenfalls auf seine tiefgreifende Interaktion mit der Membranstruktur hin. Im Falle von SRB zeigten SAXS-Analysen, dass der Fluorophor an der Lipiddoppelschicht adsorbiert, ohne deren innere Struktur wesentlich zu verändern. PTSA zeigte eine minimale Wechselwirkung mit der Lipidmembran. SAXS- und Dialyseexperimente bestätigten, dass PTSA auf die wässrigen Lösungen beschränkt blieb und vollständig von der Liposomenoberfläche entfernt werden konnte. Im Vergleich zu den etablierten Liposomen, die SRB verkapselten, zeigten Liposome, die IR-783 und PTSA einschlossen, veränderte Komplementaktivierungsmuster. In beiden Fällen wurde für die untersuchten Liposomen (mit niedrigem und hohem Cholesteringehalt, Antikörper- oder Lipopolysaccharid (LPS)-modifiziert) im Vergleich zu den entsprechenden SRB-verkapselnden Äquivalenten eine geringere komplementinduzierte Lyse erzielt. Diese Ergebnisse zeigen welche Auswirkungen Moleküle bei der Verkapselung in Liposomen auf deren Eigenschaften haben können und unterstreichen die Notwendigkeit der Analyse solcher Effekte bei der Entwicklung von liposomen-basierten Anwendungen im Diagnostikbereich. Die abweichenden Reaktivitäten bei Verwendung der unterschiedlichen Fluorophore schränkten außerdem eine anschließende Entwicklung eines Multiplex Komplement Assays ein.
Aufbauend auf diesem Verständnis wurde das Ziel, eine Plattform zur spezifischen Analyse der drei Komplementwege zu entwickeln, trotzdem weiterverfolgt. Mannan-funktionalisierte Liposomen (Man-Liposomen) zur selektiven Aktivierung des Lektinwegs wurden durch sorgfältige Optimierung der Mannan Aminierung und der Kopplungsbedingungen erreicht. Es konnte gezeigt werden, dass diese Liposomen die Lyse durch das Komplement System über das mannose-bindende Lektin (MBL) auslösen. Die Spezifität wurde mit Inhibitoren bestätigt, die die Funktion der Komplementproteine C1q, C1s, MBL, MASP-2, Faktor B und C5 einschränken. Die Man Liposome erwiesen sich als langzeitstabil und wurden an einer Kohorte von 97 gesunden humanen Serumproben validiert. Dabei konnte eine starke Korrelation mit einem C3b ELISA gezeigt werden (Pearson's r = 0.77). Anschließend wurde der Assay für die spezifische Analyse des klassischen und des alternativen Wegs angepasst. Für den klassischen Weg wurden zwei Liposomendesigns untersucht: Antikörper-modifizierte Liposomen und Liposomen mit hohem Cholesteringehalt (hiChol-Liposomen). Mit Biotin funktionalisierte Liposomen, an die anschließend anti-Biotin Antikörper gebunden wurden, lösten zuverlässig die spezifische Aktivierung des klassischen Wegs aus. Dies konnte durch Inhibitorstudien bestätigt werden. HiChol-Liposomen wurden als einfachere Alternative zur Antikörpermodifikation untersucht. Mittels Inhibitorstudien konnte auch für diese die spezifische Aktivierung des klassischen Komplementwegs bestätigt werden. Allerdings zeigten hiChol-Liposomen keine Korrelation mit dem C3b ELISA, was darauf hindeutet, dass bei der durch Cholesterin ausgelösten Aktivierung zusätzliche Faktoren im Vergleich zum Antikörper getriggerten Kontrolltest eine Rolle spielen könnten. Für den alternativen Weg wurden die Liposomen mit LPS modifiziert, und die Spezifität wurde unter Mg²⁺/EGTA Bedingungen bestätigt. Mg²⁺/EGTA wurde verwendet um die Aktivität des klassischen und des Lektinwegs zu unterdrücken. Jedoch konnte eine signifikante Anzahl der Serumproben keine Lyse der LPS-Liposomen induzieren, obwohl sie im ELISA eine ausreichende Aktivität zeigten. Dies unterstreicht, dass für eine zuverlässige Messung des alternativen Weges eine weitere Optimierung der Liposomen Oberflächenchemie oder die Verwendung von Komplementtriggeralternativen, anstelle von LPS notwendig ist.
Grundlegende Studien, in denen die zukünftige Anwendbarkeit von Plasma als Alternative zu Humanserum untersucht wurde, zeigten die Vielseitigkeit des Assays. EDTA- und citrat-behandeltes Serum stellte nach Wiederherstellung ausreichend hoher Kalzium- und Magnesiumionenkonzentrationen die Komplementaktivität wieder her. ETDA-behandeltes Serum erwies sich als besser geeignet, da 90 % der Aktivität einer unbehandelten Serumkontrolle wieder hergestellt werden konnte im Vergleich zu 71 % bei Citrat-behandeltem Serum. Höhere Aktivitäten konnten im Falle von Citrat-Serum nicht wiederhergestellt werden, da die Liposomen destabilisiert wurden, vermutlich durch zu hohe Ionenkonzentrationen, die aufgrund der geringeren Effizient der Komplexierung von Citrat erforderlich waren. Dies schränkt die Anwendung von Citrat-Serum bzw. Citrat Plasma in diesem liposomen basierten Assay ein. Zuletzt wurde der Assay mit Tierseren getestet. Dabei zeigten sich artspezifische Unterschiede in der Komplementreaktivität. Während Mäuseserum keine Liposomenlyse zeigte, führten Schweine- und Rattenseren in Abhängigkeit von den verwendeten Liposomen zu einer komplement-induzierten Lyse. Im Gegensatz zu Humanserum, lysierte Schweineserum Liposomen mit niedrigem Cholesteringehalt effektiver als solche mit hohem Cholesteringehalt. Weitere Experimente mit pegylierten Liposomen mit unterschiedlichem Cholesteringehalt zeigten eine dosisabhängige Reaktion, die bei 20 %mol. Cholesterin ihren Höhepunkt erreichte. Bei allen untersuchten Seren unterschiedlicher Rattenstämme wurde eine ähnliche Reaktion ermittelt. Liposomen mit niedrigem Cholesteringehalt lösten eine mäßige Lyse und Liposomen mit hohem Cholesteringehalt lösten eine etwas stärkere Lyse aus. LPS modifizierte Liposomen verstärkten die Lyse weiter, während pegylierte Liposomen stabil blieben, sofern sie nicht mit Antikörpern modifiziert wurden. Zusammenfassend bietet diese auf Liposomen basierende Assay-Plattform einen leistungsstarken und vielseitigen Ansatz für die funktionelle Komplementanalyse in der Diagnostik, Therapieüberwachung und Grundlagenforschung, trotzdem bedarf es noch weiterer Optimierung der Liposomenoberflächenchemie und Korrelationsstudien, um das volle Potenzial dieses Assays auszuschöpfen.