Das Hepatitis-A-Virus (HAV) und das Hepatitis-E-Virus (HEV) sind weltweit die häufigsten Erreger akuter Virushepatitiden. Steigende Fallzahlen erfordern eine effiziente molekulare Typisierung.
Die Sanger-Sequenzierung gilt zwar weiterhin als Goldstandard, stößt jedoch aufgrund des hohen manuellen Laboraufwands und eingeschränkter Automatisierungsmöglichkeiten zunehmend an ihre Grenzen, insbesondere bei steigendem Probendurchsatz. Ziel der Arbeit war die Entwicklung und Validierung eines bioinformatisch automatisierten Sequenzierworkflows mittels Oxford Nanopore Technologies als ressourceneffiziente Alternative für die klinische Routine.
Aus 99 klinischen Proben wurden 262 Sequenzen mit dem Rapid Barcoding Kit 96 auf einem MinION Mk1C generiert. Die bioinformatische Auswertung erfolgte durch eine modular aufgebaute Pipeline (Bash, R und Python), die ein adaptives Mapping gegen ein repräsentatives Referenzset der Zielregionen (HAV net, HAV VP1, HEV net und HEV ORF1) durchführt. Zusätzlich wurden der Einfluss der Probenaufreinigung (Macherey-Nagel-Kit) sowie variierender DNA-Konzentrationen auf die Datenqualität untersucht.
Die generierten Konsensussequenzen zeigten eine hohe Übereinstimmung (> 98 %) mit den Sanger-Referenzdaten. Als zentraler Qualitätsparameter zur Differenzierung valider viraler Signale von Kontaminationen erwies sich die mediane Lesetiefe. Fragment-spezifische Cut-off-Werte wurden bei 54 Reads (HAV), 163 Reads (HEV net) und 46 Reads (HEV ORF1) definiert. Sowohl die Aufreinigung als auch der Einsatz höherer DNA-Mengen steigerten die Zuverlässigkeit der Ergebnisse signifikant, während die Anzahl unbestimmter Nukleotide (N-Calls) als unzuverlässiges Kriterium eingestuft wurde.
Der Workflow bietet eine zuverlässige, zeitsparende und hochdurchsatzfähige Alternative zur Sanger-Sequenzierung. Die Arbeit liefert damit einen technischen Leitfaden für die Implementierung der Nanopore-Sequenzierung sowie spezifische Qualitätskriterien, die maßgeblich zur Standardisierung und Qualitätssicherung in der molekularen Hepatitis-Diagnostik beitragen.

Hepatitis A virus (HAV) and Hepatitis E virus (HEV) are leading causes of acute viral hepatitis worldwide. Increasing incidence, particularly in resource-limited settings, highlights the need for molecular typing. While Sanger sequencing remains the gold standard, it is increasingly reaching its limits due to high manual workload and limited automation. This study aimed to develop and validate a bioinformatically automated sequencing workflow using Oxford Nanopore Technologies as a resource-efficient alternative for routine clinical diagnostics.
From 99 clinical samples, 262 sequences were generated using the Rapid Barcoding Kit 96 on a MinION Mk1C. Bioinformatic analysis was performed via a modular pipeline (Bash, R and Python) utilizing adaptive mapping against a representative reference set of target regions (HAV net, HAV VP1, HEV net, HEV ORF1). In addition, the impact of nucleic acid purification (Macherey-Nagel Kit) and varying DNA concentrations on data quality was evaluated.
The generated consensus sequences showed high concordance (> 98 %) with Sanger reference data. Median read depth was identified as a key quality parameter for distinguishing valid viral signals from contamination. Fragment-specific cutoff values were defined at 54 reads (HAV), 163 reads (HEV net) and 46 reads (HEV ORF1). Both purification and higher template concentrations significantly improved result reliability, while the number of undetermined nucleotides (N-calls) proved unreliable as a standalone quality criterion.
The workflow offers a reliable, time-saving and high-throughput alternative to Sanger sequencing. This study provides a methodological framework and specific quality criteria for implementing Nanopore sequencing, significantly contributing to the standardization and quality assurance of molecular hepatitis diagnostics.