Die reversible raum-zeitliche Kontrolle von Enzymen mit Licht durch den Einbau von lichtschaltbaren, unnatürlichen Aminosäuren (UAs) ist von wachsendem Interesse für verschiedene biologische, biotechnologische sowie industrielle Anwendungen. Allerdings wird die Herstellung dieser Enzyme, welche wir schaltbare „Photoxenasen“ nennen, eingeschränkt durch fehlende Kenntnisse über den zugrundeliegenden molekularen Mechanismus der Lichtregulation. In diesem Projekt wird ein zweigleisiger Ansatz zur Untersuchung der Prinzipien der Lichtregulation von Photoxenasen verfolgt. Zu diesem Zweck wird die Asparaginase-Glutaminase EcAII aus Escherichia coli verwendet, welche alle von uns gesetzten Kriterien an ein Modellsystem erfüllt: i) Sie weist eine inaktive und aktive Konformation auf, was das Design von schaltbaren Photoxenasen zu erleichtern scheint; ii) Sie folgt einem „Induced-fit“ katalytischen Mechanismus basierend auf verfügbaren umfangreichen biochemischen und strukturellen Daten; und iii) Die Lichtregulation ihrer Glutaminaseaktivität ist von potentieller Signifikanz für ihre Anwendung als Chemotherapeutikum. Das Projekt wird in eine „Bottom-Up“ und eine „Top-Down“ Herangehensweise strukturiert, um die Wechselwirkung zwischen dem Lichtregulationsfaktor (LRF) als Maß für die Effizienz der Lichtregulation und bestimmten enzymatischen Reaktionsteilen zu analysieren. Insbesondere wollen wir klären, ob die Lichtschaltung nur einen katalytischen Reaktionsschritt oder mehrere katalytische Reaktionsschritte, wie zum Beispiel die Substrat-induzierte Loopschließung oder den chemischen Schritt, beeinträchtigt. Im „Bottom-Up“ Ansatz wollen wir mittels der Stopped-Flow Technologie Kinetiken im prästationären Zustand aufnehmen sowie unterschiedliche biochemische Analysen durchführen, um Reaktionsschritte zu identifizieren, welche durch die Lichtregulation in zwei zuvor hergestellten EcAII-Photoxenasen beeinträchtigt werden. Die Auflösung dieses Ansatzes ist limitiert durch einen moderaten LRF von 3–7 sowie der Heterogenität der UA-Konfiguration in den beiden EcAII-Photoxenasen. Deshalb werden wir eine zweite, komplementäre „Top-Down“ Herangehensweise einsetzen, in welcher wir die katalytischen Reaktionsschritte durch zwei Protein-Engineering Strategien modifizieren und die daraus resultierenden Veränderungen des LRF analysieren. Während investigative, gerichtete Evolution gezielte Modifizierungen in spezifischen, enzymatischen Reaktionsteilen einführt, wird der Austausch des EcAII-Gerüstes durch homologe Asparaginase-Glutaminasen drastischere Änderungen der katalytischen Reaktion etablieren. Letztendlich werden wir die Ergebnisse von beiden Herangehensweisen in einer kombinierten Auswertung vereinen, um ein ganzheitliches Modell für die Lichtregulation von Asparaginase-Glutaminasen zu entwerfen. Dadurch erhoffen wir uns neue Erkenntnisse zu liefern, welche die Herstellung von schaltbaren Photoxenasen verbessern könnten.
