RNA Moleküle spielen eine zentrale Rolle in der Zelle, sind allerding anfällig für Fehlfaltung. RNA Helikasen, die diese Fehlfaltungen auflösen, sind daher essentiell für die meisten Organismen. Eine große Gruppe innerhalb der RNA Helikasen stellen die ATP-abhängigen DEAD-box Proteine dar. Sie bestehen aus 2 RecA Domänen die sich im ligandfreien Zustand unabhängig voneinander bewegen. Die Bindung von ATP und Doppelstrang RNA (DsRNA) führt zur Bildung eines rigiden Komplexes und zur Destabilisierung der DsRNA. Dies bewirkt die Entwindung des Doppelstranges. Für den ATP/DsRNA gebundenen Zustand sowie einige weitere Intermediate der Enwindungsreaktion fehlen bisher strukturelle Informationen. Das Ziel dieses Antrages ist es daher die Einblicke in die Struktur und Dynamik dieser Intermediate am Beispiel der DEAD-box Helikase DbpA aus E. coli zu gewinnen. Dabei stehen zwei Fragestellungen im Fokus, die hauptsächlich mittels moderner NMR Techniken und in vitro Aktivitätstests beantwortet werden sollen:1. Der Einfluss der C-terminalen RNA-Bindedomäne (RBD) auf die Entwindungsaktivität: Zusätzlich zu den kanonischen RecA Domänen weist DbpA eine C-terminale RNA-Bindedomäne auf. Diese bindet im Laufe der Ribosomenbiogenese direkt an das Peptidyl-Transferase-Zentrum der 23S rRNA und verankert damit DbpA am Prä-Ribosom. Die Bindung der rRNA an die RBD stimuliert dabei die Entwindungsaktivität von DbpA mittels eines bislang unverstandenen Mechanismus. Die RBD interagiert dabei mit der C-terminalen RecA Domäne. Zur Aufklärung des Aktivierungsmechanismus werden wir die Struktur eines Konstrukts bestimmen, das beide Domänen umfasst, und darauf aufbauend den Einfluss der RNA-Bindung auf die Struktur und Dynamik von DbpA untersuchen. Zudem werden wir chemische Sekundärstrukturuntersuchungen in vivo an der 23S rRNA durchführen um durch einen Vergleich zwischen Wildtyp- und DbpA-Knockout-Stamm die Zielsequenzen der DbpA-Entwindungsaktivität zu identifizieren.2. Der molekulare Mechanismus der Doppelstrangentwindung: Hier werden wir DbpA als Modellsystem verwenden um einen Einblick in den Mechanismus der Doppelstrangentwindung zu erhalten. Dazu werden wir DbpA in den Zwischenzuständen der Entwindungsreaktion stabilisieren und diese dann mittels NMR und/oder Röntgenstrukturanalyse charakterisieren. Der Fokus wird dabei auf der Untersuchung des ATP/DsRNA gebundenen Zustands liegen um die strukturelle Basis für die Destabilisierung des RNA Doppelstranges aufzuklären. Die geplanten Experimente werden somit neue Einblicke in die strukturellen und dynamischen Grundlagen der Funktionsweise von DEAD-box Helikasen ermöglichen.
