P2X7-Rezeptoren (P2X7R) sind Liganden-gesteuerte, nicht-selektive Kationenkanäle, die durch hohe Konzentrationen von extrazellulärem ATP aktiviert werden, welches während Entzündung und Gewebeverletzung freigesetzt wird. P2X7R zeigen die höchste Expression in Makrophagen, wo sie für die angeborene Immunität unentbehrlich sind. Aktivierung des P2X7R induziert nicht nur einen Kationenstrom, sondern führt ebenfalls zur Bildung einer nicht-selektiven großen Kanalpore, die durchlässig ist für Moleküle bis zu einer Größe von 900 Da, was letztlich zur Zelllyse führt. Stimulation von P2X7R führt zu Membranblebbing, sowie zur Aktivierung von Metalloproteasen und Caspasen. Dies induziert Scrambling von Membranphospholipiden mit der Exposition von Phosphatidylserin, Bildung von Mikrovesikeln und Exosomen und anschließendem Zelltod durch Apoptose. Das für Ca2+ aktiviertes Phospholipidscrambling verantwortliche Protein wurde als Anoctamin 6 (Ano6, TMEM16F) identifiziert. Ano6 induziert außerdem einen Ca2+ aktivierten Cl- sowie einen nichtselektiven Kationenkanal. Ano6 gehört zu einer Familie von 10 Paralogen und ist eine Komponente des ubiquitären sog. auswärts-gleichrichtenden Chloridionenkanals, der Zellvolumen steuert und während der Apoptose aktiviert wird. Daher vermuten wir, dass Ano6 auch während der Stimulation von P2X7 Rezeptoren aktiviert wird. Im vorliegenden Projekt soll untersucht werden, ob Ano6 für die P2X7R-induzierten zellulären Effekte wie Ionenströme, Zellschrumpfung, Porenbildung, Phospholipidscrambling und Apoptose verantwortlich ist. Diese Vorgänge sind beteiligt bei der Phagozytose und Eliminierung von Bakterien durch Makrophagen. ATP-induzierte Ionenströme, Volumenregulation, Migration, Apoptose, Phagozytose und das Abtöten von Bakterien sollen an peritonealen Makrophagen von Wildtyp- und Ano6- Knockoutmäusen untersucht werden. Die Ergebnisse sollen an humanen THP-1 Makrophagen reproduziert werden, wo auch eine weitere detaillierte Analyse von Ionenströmen sowie intrazelluläre Ca2+ Signale und Phospholipidscrambling geplant ist. In rekombinanten Zellsystemen wie überexprimierenden HEK293 Zellen und Oozyten von Xenopus laevis werden weitere molekulare Aspekte der Ano6-Aktivierung, wie die Rolle von intrazellulärem Ca2+ und des C-terminalen Endes des P2X7 Rezeptors untersucht. Wir werden versuchen weitere beteiligte und noch unbekannte Zielproteine mit einer kürzlich entwickelten mikroskopischen Screening-Methode zu identifizieren. Wir erwarten von dem Projekt ein Verständnis der Physiologie des P2X7-Rezeptors und der grundlegenden Bedeutung von Ano6 für die Makrophagenfunktion und angeborenen Immunität.
