Die Einzelmolekül-Analyse hat ein breites Interesse gefunden, unter anderem weil sie die ultimative Nachweisgrenze erreichen kann. In den letzten Jahren wurden große Fortschritte in der Fluoreszenz-basierten Einzelmoleküldetektion gemacht. Analytische Anwendungen sind jedoch stark durch das hohe Hintergrundsignal der Fluoreszenzdetektion eingeschränkt. Das Ziel dieses Projektes ist es, einen Einzelmolekül-Immunoassay zu entwickeln, der die Einschränkungen gängiger Methoden zur Einzelmolekül-Detektion umgeht und somit wesentlich empfindlicher ist als konventionelle Immunoassays: (1) Die hohe Hintergrundfluoreszenz wird durch den Einsatz von Photonen-aufkonvertierenden Nanopartikeln als Nachweissystem vermieden. Diese lumineszierenden Nanopartikel können unter Beleuchtung mit Nahinfrarot-Licht angeregt werden, was die Autofluoreszenz und Lichtstreuung entscheidend verringert. (2) Um ein größeres Probenvolumen für die Analyse zugänglich zu machen, wird der Analyt auf der Oberfläche von Mikrometer-großen Kugeln eingesammelt und somit vorkonzentriert. Solche Mikrokugeln können anschließend unter dem Mikroskop einzeln ausgelesen werden.Im ersten Teil des Forschungsprojekts haben wir ein Aufkonversionsmikroskop aufgebaut, mit dem sich einzelne UCNPs detektieren lassen, und einen Einzelmolekül- Immunoassay (ULISA) für den Krebsmarker Prostata-spezifisches Antigen (PSA) entwickelt. Der Einzelmolekül-ULISA hat eine Nachweisgrenze von 1.2 pg mL−1 PSA in 25 % Blutserum und ist somit etwa 10-fach empfindlicher als kommerzielle Immunoassays (publiziert in Analytical Chemistry 2017, 89, 11825-11830). Wir haben zudem große Arrays aus zehntausenden Femtoliter-Kavitäten hergestellt, um darin Mikrokugeln aufzunehmen und individuell zu registrieren. Im zweiten Teil des Projektes werden wir den Mikrotiterplatten-Immunoassay auf einen Mikrokugel-Assay umstellen, um die Nachweisstärke der Einzelmoleküldetektion weiter zu steigern. Mikrokugeln, die mit einem spezifischen Antikörper beschichtet sind, werden in einer Analyt-Lösung dispergiert. Nach Bindung des Analyten an die Mikrokugeln erfolgt die Zugabe des UCNP-Nachweissystems. Die Mikrokugeln werden anschließend auf einen Femtoliter-Array geladen und unter dem Mikroskop einzeln registriert. Es ist wichtig, eine große Anzahl der Kugeln gleichzeitig zu registrieren, weil bei geringer Analytkonzentration nur wenige Kugeln ein Analyt-Molekül tragen. Der Femtoliter-Array ermöglicht es, die An- bzw. Abwesenheit einzelner Immunokomplexe – und somit auch einzelner Analyt-Moleküle - auf der Oberfläche jeder einzelnen Mikrokugel nachzuweisen. Wir werden diesen Assay sowohl für den Multiplex-Nachweis von mehreren Analyten verwenden als auch für den Nachweis einzelner Viruspartikel in Abwasser.
