In den letzten drei Jahren haben wir Einzelzell-SLAM-Seq (scSLAM-seq) sowie das bioinformatische Tool GRAND-SLAM entwickelt, um Echtzeit-Transkriptionsanalysen auf Einzelzellenebene mit beispielloser Auflösung durchzuführen. Unser Ansatz ermöglicht erstmals Dosis-Wirkungs-Analysen auf Einzelzellenebene. Wir etablierten scSLAM-seq, indem wir transkriptionelle Regulation sowie die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen in den ersten zwei Stunden der lytischen Infektion von Fibroblasten mit dem murinen Zytomegalievirus (CMV) analysierten. Hier wollen wir jetzt die bioinformatischen Verfahren ausbauen, scSLAM-Seq für hochdurchsatzfähige, tröpfchen-basierte scRNA-seq Verfahren weiterentwickeln sowie dessen großes Potenzial für funktionelle Genomanalysen ausschöpfen.1. In den letzten Monaten haben wir scSLAM-seq für die kommerzielle 10x Genomics Chromium Plattform weiterentwickelt. Dies erlaubt nun zeitlich aufgelöste Einzelzellanalysen mit Tausenden von Zellen und machte diese Technik breit verfügbar. Es ist davon auszugehen, dass sich scSLAM-seq in vielen Bereichen etablieren wird. Es existiert im Moment kein Tool, mit dem man solche Daten für Tausende von Zellen auswerten kann. Wir werden GRAND-SLAM zum Standard-Tool für solche Experimente weiterentwickeln.2. Wir haben prototypische Implementierungen für Qualitätskontrollen und explorative Analysen solcher Daten. Wir werden diese erweitern, in einem R Paket zusammenfassen, und dieses öffentlich verfügbar und nutzbar machen. Das Hauptziel dabei ist, reproduzierbare Analysen zu gewährleisten, und Fallstricke, die sich unserer Erfahrung nach häufig in solchen Experimenten ergeben, erkennbar zu machen. Dies ist essentiell sowohl für die weiteren Ziele in diesem Antrag, als auch für die weitere Nutzung unserer Technik in anderen Arbeitsgruppen.3. Wir werden „Heterogenitäts-Sequenzierung“ entwickeln. scSLAM-seq erlaubt es, den Zustand jeder einzelnen Zelle vor einer Perturbation mit dem Zustand hinterher in Beziehung zu setzen. Dies erlaubt es, die Heterogenität der Zellen „vorher“ auszunutzen, um funktionelle Beziehungen zu einer beliebigen Kenngröße „hinterher“ zu erkennen. Wir werden dafür ein flexibles statistisches Framework entwickeln (und in das R Paket einbetten), mit dem solche Analysen unter Berücksichtigung der Besonderheiten von Einzelzellanalysen („dünne“ Daten, „drop-outs“, Überdispersion) durchführbar sind.4. Wir werden „Heterogenitäts-Sequenzierung“ einsetzen, um pro- und antivirale Gene relevant für Zytomegalievirus-Infektion zu identifizieren. Dies beinhaltet sowohl Faktoren, die für die allgemeine Infektionseffizienz eine Rolle spielen, also auch feiner aufgeschlüsselte Analysen, um Einflüsse auf bestimmte Phasen der Infektion oder der zellulären Immunantwort aufzuschlüsseln. Kandidaten werden mittels Gen-Knockdowns und fluoreszenten Reporter-Viren validiert.
