Proteine sind oft hochdynamisch und verändern ihre Form je nach Zustand. Diese Konformationsänderungen sind besonders relevant für Enzyme, bei denen der Katalysezyklus mit der Proteindynamik verknüpft ist. Unser derzeitiges Wissen über molekulare Maschinen beschränkt sich jedoch häufig auf statische Abbildungen dieser Komplexe. Hier schlagen wir vor, Proteinbewegungen und dynamische Substratwechselwirkungen im eukaryotischen RNA- Exosomkomplex zu quantifizieren. Diese essentielle molekulare Maschine spielt eine zentrale Rolle beim Abbau und der Verarbeitung einer großen Anzahl von RNAs. Die katalytisch aktive Form des Enzymkomplexes umfasst ein Minimum von 10 verschiedenen Proteinketten (Exo-10), die sich zu einer molekularen Maschine von 400 kDa zusammenlagern. Es wurden zwei strukturell unterschiedliche Konformationen des Exo-10-Komplexes beschrieben und veröffentlichte Daten legen nahe, dass diese mit verschiedenen Arten des RNA-Abbaus und somit mit verschiedenen biologischen Funktionen verbunden sind. Um Dynamik und Funktion im Exo-10- Komplex direkt in Beziehung zu setzen, werden wir hier zwei komplementäre strukturbiologische Methoden anwenden. Im ersten Teil des Antrags werden modernste Methyl-TROSY Lösungs-NMR- Techniken zur Quantifizierung der Dynamik im Exo-10-Komplex eingesetzt. Wir interessieren uns besonders für strukturelle Veränderungen, die durch verschiedene RNA-Substrate hervorgerufen werden. Der vollständig asymmetrische Exo-10- Komplex ist einer der herausforderndsten Komplexe, die jemals mit NMR-Methoden untersucht wurden. Unsere vorläufigen Daten zeigen jedoch, dass wir lokale Bewegungen und RNA-Wechselwirkungen aufzeichnen können. Damit etablieren wir, dass große und vollständig asymmetrische, eukaryotische molekulare Maschinen für detaillierte NMR Studien geeignet sind, wodurch die Grenzen der Technik erheblich erweitert werden. Im zweiten Teil des Antrags werden wir Kryo-EM-Methoden verwenden, um Exo-10-Strukturen in Komplex mit einer Vielzahl verschiedener RNA-Substrate zu bestimmen. Diese statischen Schnappschüsse des Komplexes sind für eine genaue Interpretation unserer NMR-Daten erforderlich und können veranschaulichen, auf welchem Weg RNA-Substrate zu den aktiven Zentren geführt werden. Vorläufige Daten zeigen, dass wir Kryo-EM- Karten von ausreichender Qualität erhalten können. Das Projekt wird umfangreiche NMR- und Kryo-EM-Daten für einen großen Proteinkomplex liefern. Dies versetzt uns in die einzigartige Lage untersuchen zu können, inwieweit NMR-quantifizierte Molekülbewegungen in Kryo-EM-Daten sichtbar sind. Diese Erkenntnisse sind von allgemeinem Interesse, da sie aufzeigen wie Kryo-EM-Daten durch lösungsbasierte Methoden ergänzt werden können, um molekulare Mechanismen vollständig zu entschlüsseln. Zusammengefasst werden unsere Daten funktionale Einblicke in den zentralen RNA-Exosom-Komplex liefern und gleichzeitig die strukturbiologische Methodik weiterentwickeln.
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