Eukaryotische 5 '→ 3' Exoribonukleasen sind große (> 100 kDa) Enzyme, die prozessiv Nukleotide vom 5'-Ende einzelsträngiger RNA entfernen und dabei Mononukleotide freisetzen. Eukaryotische Organismen enthalten zwei eng verwandte 5 '→ 3' Exoribonukleasen: das cytoplasmatische Xrn1-Enzym (auch PACMAN genannt), das am Abbau von mRNA beteiligt ist, und das nukleare Xrn2-Enzym (auch Rat1 genannt), das beim Abbau und der Verarbeitung einer Vielzahl von RNA-Spezies eine Rolle spielt. Die wenigen bekannten statischen Strukturen von Xrn1 und Xrn2 zeigen, dass das aktive Zentrum nur für einzelsträngige RNA zugänglich ist. Unterschiede zwischen diesen Strukturen legen jedoch nahe, dass die prozessive Translokation des Substrats zum aktiven Zentrum mit Konformationsänderungen in den Enzymen verbunden ist. Ziel dieses Antrags ist es zu untersuchen, wie diese und andere dynamische Prozesse in Xrn1 und Xrn2 mit der Funktion korrelieren. Experimentell werden wir in großem Umfang Methyl-TROSY- und 19F-NMR-spektroskopische Methoden verwenden, um Bewegungen in Xrn1 und Xrn2 mit einer hohen räumlichen Auflösung direkt zu quantifizieren. In Vorarbeiten haben wir gezeigt, dass diese Ansätze qualitativ hochwertige Daten liefern, die detaillierte Einblicke in Populationen und Austauschraten der angenommenen Konformationszustände liefern können. Unsere umfangreichen NMR-Studien werden somit ein umfassendes und einzigartiges Bild der Dynamik dieser Enzyme liefern. Änderungen dieser Dynamik in Gegenwart von Inhibitoren, Substraten und Bindungspartnern (z. B. DcpS und Rai1, die die Aktivität von Xrn1 bzw. Xrn2 modulieren) oder in Abwesenheit spezifischer Domänen werden Einblicke in den enzymatischen Mechanismus liefern, der die katalytische Aktivität reguliert. Darüber hinaus werden wir Xrn1- und Xrn2-Enzyme entwerfen, die eine veränderte Dynamik aufweisen, und bestimmen, wie dies die katalytischen Umsatzraten beeinflusst. Zusammengenommen ermöglichen diese Daten die Herleitung eines (potenziell) direkten funktionellen Zusammenhangs zwischen Enzymdynamik und katalytischer Aktivität. Unsere Ergebnisse werden weit über die statischen Strukturinformationen hinaus gehen, die für Xrn1 und Xrn2 bekannt sind. Insbesondere werden wir einzigartige Einblicke in dynamische Prozesse gewinnen, die für die katalytische Aktivität und deren Regulierung wichtig sind. Diese Ergebnisse werden auch allgemeine Auswirkungen auf unser Verständnis von Enzymen haben, da nur wenige Daten vorliegen, die Proteinbewegungen mit Funktionalität verknüpfen. Darüber hinaus steht unsere NMR-Arbeit an der Spitze dessen, was derzeit technisch möglich ist.
