Viele RNA-Moleküle bestehen nicht nur aus den vier Standard-Basen sondern können eine Reihe von Modifikationen tragen. Dies ist vor allem bei tRNA oder ribosomaler RNA (rRNA) zu beobachten. Solche Modifikationen, allen voran m6A, konnten auch auf mRNA entdeckt werden, wo sie Auswirkungen auf die Genexpression haben können. Neben m6A konnten, wenn auch in sehr kleinen Mengen, m1A, m5C oder pseudoU auf mRNAs gefunden werden. Die Identifizierung erweist sich allerdings oft als schwierig, da gute und spezifische Antikörper lediglich gegen m6A zu Verfügung stehen. Es ist daher Ziel unseres Projektes monoklonale Antikörper gegen modifizierte Basen herzustellen. Wir konnten in der ersten Förderperiode Antikörper gegen m6A, m26A, m1A, m5C und pseudoU herstellen. Auf Basis unserer Expertise werden wir nun im zweiten Abschnitt Antikörper gegen m3C, m4C, m1G, m2G, m5U, m1pseudoU und m3U etablieren. Darüber hinaus planen wir Antikörper gegen Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) herzustellen, da kürzlich gezeigt wurde, dass NAD am 5’-Ende von mRNAs zu finden ist und die Funktion noch weitestgehend unverstanden ist.Basenmethylierungen werden durch spezifische Methyltransferasen katalysiert. Ein Dimer aus METTL3 und METTL14 ist zum Beispiel für die Erzeugung von m6A verantwortlich. In der ersten Förderperiode haben wir vorhergesagt, dass die Methyltransferasen METTL2, 4, 6 und 8 vermutlich RNA modifizieren. In Vorarbeiten konnten wir in der Tat feststellen, dass zumindest METTL8 mit RNA in Verbindung steht. Wir wollen nun im Folgeantrag diese Enzyme genauer Charakterisieren. Wir möchten herausfinden (i) welche Modifikation jeweils erzeugt wird, (ii) welche RNAs modifiziert werden und (iii) welches RNA Motiv für die Modifikation gebraucht wird. In der ersten Förderperiode ist es uns gelungen, die Methyltransferasen rekombinant herzustellen. Diese Proteine sollen nun für Methylierungsexperimente sowie strukturelle Untersuchungen herangezogen werden.
