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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-2564
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.10197
Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
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Open Access Art: | Primärpublikation |
Datum: | 18 Mai 2004 |
Begutachter (Erstgutachter): | Hans Robert (Prof. Dr. Dr.) Kalbitzer |
Tag der Prüfung: | 7 Mai 2003 |
Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
Stichwörter / Keywords: | Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie , Kieselalgen , Zellwandbildung , Strukturaufklärung , Restdipolkopplungen , SIAM-Experiment , Orientierung , multidimensional NMR spectroscopy , diatoms , cell wall formation , structure determination , residual dipolar couplings |
Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
Status: | Veröffentlicht |
Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
Dokumenten-ID: | 10197 |
Zusammenfassung (Deutsch)
In dieser Arbeit wurde die erste Struktur eines Zellwandproteins einer Kieselalge mit Flüssigkeits-NMR-Spektroskopie bestimmt: Die Struktur der PSCD4-Domäne des Zellwandproteins Pleuralin-1 aus Cylindrotheca fusiformis. Die PSCD-Domänen (87 bzw. 89 AA) sind hoch konserviert und wurden nur in den Mitgliedern der Pleuralin-Familie (früher HEP) gefunden. Der Name PSCD bezieht sich auf die am ...
Zusammenfassung (Deutsch)
In dieser Arbeit wurde die erste Struktur eines Zellwandproteins einer Kieselalge mit Flüssigkeits-NMR-Spektroskopie bestimmt: Die Struktur der PSCD4-Domäne des Zellwandproteins Pleuralin-1 aus Cylindrotheca fusiformis. Die PSCD-Domänen (87 bzw. 89 AA) sind hoch konserviert und wurden nur in den Mitgliedern der Pleuralin-Familie (früher HEP) gefunden. Der Name PSCD bezieht sich auf die am häufigsten vorkommenden Aminosäuren (~22% Pro, ~11% Ser, ~11% Cys und ~9% Asp). Während die PSCD-Domänen 70% bis 92% Sequenzidentität untereinander aufweisen, zeigen sie keine signifikante Homologie zu anderen Proteinen in den gängigen Datenbanken. Aufgrund der ungewöhnlichen Aminosäurezusammensetzung erwarteten wir ein neues Faltungsmotiv, welches das PSCD4 auch tatsächlich ausbildet.
Aufgrund der signifikanten Abweichungen der chemischen Verschiebungen von den Random-Coil-Werten, scheint der Kern der Domäne gut strukturiert zu sein. Allerdings deuten die Analysen der chemischen Verschiebungen mit den Computerprogrammen CSI und TALOS darauf hin, dass PSCD4 keine kanonischen Sekundärstrukturelemente ausbildet. Die Bestimmung der Struktur in Lösung wurde durch die relativ geringe Anzahl an beobachtbaren NOE-Kontakten erschwert. Des Weiteren kommt es, aufgrund des Überwiegens weniger nicht aromatischer Aminosäuren, zu vielen Überlagernungen in den Spektren. Um diese Hindernisse zu umgehen, wurde die Position von drei der fünf Disulfidbrücken, ihre Existenz ist anhand ihrer chemischen Verschiebungen gezeigt, mit biochemischen Methoden, wie enzymatische Spaltung, HPLC-Analyse, Massenspektroskopie und Edman-Abbau bestimmt. Zusätzlich zu den Positionen der Disulfidbrücken und den Abstandsinformationen aus den NOESY-Spektren wurden Restdipolkopplungen zwischen dem HN und N gemessen, welche sehr wertvolle Strukturinformationen enthalten. Informationen über den Diederwinkel F wurden dem HNCA-E.COSY-Spektrum entnommen. Wasserstoffbrückenbindungen wurden mittels des modifizierten HNCO-Experiments direkt nachgewiesen. Die Struktur der PSCD4-Domäne, ebenso wie ein Modell aller fünf PSCD-Domänen aus Pleuralin-1 wurde mittels Simulated Annealing mit dem Computerprogramm CNS berechnet.
Der Kern der PSCD4-Struktur enthält keine klassischen Sekundärstrukturelemente und zeigt ein neues Faltungsmotiv. Er besteht aus mehreren Schleifen, welche durch die fünf Disulfidbrücken verbunden sind. Der RMSD des Kerns ist 0,109 nm (Proteinrückgrat, Reste 30 bis 80). Die aus dem Ramachandran-Diagramm bestimmte Auflösung der Struktur ist 0,4 nm. Die zwei Termini sind flexibel, was durch die Relaxationsuntersuchungen bestätigt wurde. Mit dem Computerprogramm Dali konnte gezeigt werden, dass es in der PDB-Datenbank keine der PSCD4-Domäne ähnlichen Strukturen gibt. Deshalb ist anzunehmen, dass die PSCD4-Domäne einen neuen Faltungstyp besitzt.
Aufgrund dieser Struktur kann über die Funktion des Proteins spekuliert werden. Die gesamte Oberfläche ist aufgrund von sauren Seitenketten von 12 Asparaginen und Glutamaten negativ geladen, mit Ausnahme zweier basischen Bereiche. Wie Studien zur Immunlokalisation (KRÖGER & WETHERBEE, 2000) und die Zugänglichkeit für den Abbau mit Pronase (KRÖGER et al., 1997) zeigen, ist Pleuralin-1 auf der Oberfläche der Zellwand dem umgebenden Wasser exponiert. Da die PSCD4-Domäne in Lösung nicht aggregiert, kann man spekulieren, dass die fünf PSCD-Domänen des Pleuralin-1 wie Perlen auf einer Schnur aufgereiht sind, verbunden durch verschieden lange Peptide. Diese Annahme wird von den Modellrechnungen für ein Protein aus allen 5 PSCD-Domänen bestätigt. Auf der Oberfläche der PSCD-Domäne ist eine große Anzahl potentiell modifizierbarer funktioneller Gruppen, wie die Seitenketten von Asparaginen, Serinen und Threoninen. diese können kovalent mit anderen organischen Komponenten der Zellwand, z.B. Oligosacchariden verknüpft sein. Solche Verknüpfungen könnten die Morphologie der Zellwandbildung kontrollieren (KRÖGER & WETHERBEE, 2000).
In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde eine Methode zur genauen Messung von HN-Ha-Restdipolkopplungen an unmarkierten Proteinen etabliert. Das MOCCA-SIAM-Experiment erlaubt die Bestimmung von Kopplungskonstanten mit weit höherer Genauigkeit und höherer Sensitivität als das COSY-Experiment. Der Fehler für die Restdipolkopplungen ist bei guter Spektrenqualität ±0,4 Hz. Dadurch können die Restdipolkopplungskonstanten auch bei geringeren Orientierungsgraden gemessen werden und Untersuchungen zur Orientierung im Magnetfeld, wie hier für das HPr gezeigt, durchgeführt werden.
Aufgrund der höheren Qualität der Spektren, gegenüber dem COSY, erlaubt das MOCCA-SIAM-Experiment die Bestimmung von HN-Ha-Restdipolkopplungen mit negativem Vorzeichen. Die Qualität der mit dem MOCCA-SIAM-Experiment bestimmten Restdipolkopplungen wurde am BPTI überprüft, wobei sich für 19 HN-Ha-Restdipolkopplungen innerhalb der Sekundärstrukturelemente ein Qualitätsfaktor Q = 0,286 ergab.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
This work presents the first structure of a diatom cell wall protein. The understanding of the processes involved in the formation of the species-specific and richly-ornamented silica cell walls of these unicellular algae is of great interest for material science, and in particular for "nanopatterning". The study is also of value from an ecological sciences viewpoint because diatoms are important ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
This work presents the first structure of a diatom cell wall protein. The understanding of the processes involved in the formation of the species-specific and richly-ornamented silica cell walls of these unicellular algae is of great interest for material science, and in particular for "nanopatterning". The study is also of value from an ecological sciences viewpoint because diatoms are important sources of biomineralisation and sedimentation. In the course of this work, we have also developed a new method for the measurement of homonuclear residual dipolar couplings (RDCs) with an outstanding accuracy - the MOCCA-SIAM experiment.
The object of this studies was the PSCD4 domain of the cell wall protein Pleuralin-1 of Cylindrotheca fusiformis. The PSCD domains (87 or 89 aa) are highly conserved and found only within members of the pleuralin family (formerly HEPs). The name PSCD refers to the most abundant amino acid residues (~22% Pro, ~11% Ser, ~11% Cys and ~9% Asp). While PSCD domains exhibit 70% to 92% sequence identity relative to each other, they do not show significant similarity to other proteins in the common data bases. Due to their unusual aa composition we anticipated a new fold of the domain and this proved to be the case.
The chemical shift assignment of the PSCD4 construct (112 aa in total) was obtained by the application of modern multidimensional heteronuclear NMR experiments (BMR accession number 4958). The assignment was hampered by the unusually high proportion of prolines. Because of their lack of HN-atoms, prolines interrupt the standard backbone assignment strategies. To bypass the problems caused by prolines, I used the proline-specific experiment developed by Bottomley and co-workers.
The core of the domain appeared to be well folded, based on the significant deviations of chemical shifts from random coil values. However, chemical shift analysis using the programs CSI and Talos suggested the absence of any canonical secondary structure elements. The determination of the solution structure was complicated by a relatively low number of observable NOEs. Furthermore, the spectra suffered from overlap problems, arising from the preponderance of a few types of non-aromatic aa. To help circumvent these obstacles, the positions of three of the five disulphide bridges (the existence of which was indicated by the chemical shift values) were determined using biochemical methods such as enzymatic cleavage, HPLC, mass spectroscopy, and Edman degradation. In order to solve the ambiguities concerning the two remaining disulphide bridges, I used the possibility of ambiguous assignments embedded within the ARIA script running within CNS. To supplement distance restraints based on NOEs and disulphide mapping, I also determined RDCs, which are known to be powerful restraints for structure determination. In addition to the common heteronuclear RDCs, we measured homonuclear RDCs, between HN and HA. To measure HN-HA RDCs with high accuracy we developed a new method, the homonuclear MOCCA-SIAM experiment. Information about F and Y angles was extracted from a HNCA- and a H(CA)CO[N]-E.Cosy spectrum. Finally, hydrogen bonds were directly detected using the correspondingly modified HNCO-experiment. For the final structure calculations, I used simulated annealing within the computer program CNS.
The core of the PSCD4 structure contains no classical elements of secondary structure and represents a new fold. It consists of several loops, which are connected by the five disulphide bridges. The r.m.s.d of the core is 0.109 nm (backbone of residues 30 to 80). The two termini are flexible, as could be shown by relaxation studies. Based on the solved structure of the PSCD4 domain, one can now formulate hypotheses regarding function. The entire surface of the domain is negatively charged because of the presence of 12 aspartate and glutamate sidechains, except for one basic patch, contributed by an arginine and a lysine sidechain. The Pleuralin-1 is located on the surface of the cell wall. Therefore, one can assume that parts of the highly charged surfaces of the PSCD domains are exposed to the surrounding water. Since PSCD4 does not self-associate in solution, one can speculate that the five PSCD domains of Pleuralin-1 are arranged like beads on a string, connected by flexible peptide linkers of different lengths. On the surface of PSCD domains there are a high proportion of potentially modifiable functional groups such as the sidechains of asparagines, serines, and threonines. These are likely to be covalently bound to other components of the cell wall, for example oligosaccharides, or silanol groups. Such interactions could control the morphology of cell wall development. The 3D structure introduces the possibility of rational mutagenesis to explore these hypotheses.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 13:33