| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (3MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-7445
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.10486
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 14 Dezember 2006 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Achim (Prof. Dr.) Göpferich |
| Tag der Prüfung: | 10 August 2006 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie > Lehrstuhl Pharmazeutische Technologie (Prof. Göpferich) |
| Stichwörter / Keywords: | DNS , Gentransfer , Polyethylenimin , Nanopartikel , Transfektion , Plasmid , , DNA , gene transfer , polyethylenimine , nanoparticle , transfection |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 10486 |
Zusammenfassung (Englisch)
In recent years viral as well as non-viral gene transfer emerged as a promising technique in molecular medicine as well as in basic research. Branched polyethylenimine (bPEI) has been introduced as a synthetic non- viral gene carrier. Unfortunately, its applicability is still limited by a low transfection efficacy and eminent cytotoxicity. The goal of this thesis was the design, synthesis and ...
Zusammenfassung (Englisch)
In recent years viral as well as non-viral gene transfer emerged as a
promising technique in molecular medicine as well as in basic research.
Branched polyethylenimine (bPEI) has been introduced as a synthetic non-
viral gene carrier. Unfortunately, its applicability is still limited by a low
transfection efficacy and eminent cytotoxicity.
The goal of this thesis was the design, synthesis and characterization of
polyethylenimine (PEI) - derived DNA condensing agents and of its
corresponding polyplexes, aimed to facilitate efficient and cell-compatible in
vitro plasmid DNA (pDNA: pEGFP-N1 reporter plasmid) delivery.
We synthesized per-N-methylated linear (lPMEI) and branched
polyethylenimine by the complete N-methylation of the corresponding PEI 25
kDa precursors. The corresponding tertiary polyamines built polyplexes with
pDNA, which exhibited similar hydrodynamic diameters, surface charge and
endosomolytic activity, were internalized by CHO-K1 cells to a comparable
degree, and were significantly less cytotoxic, compared to unmodified PEI -
pDNA complexes. However, the capacity to transfect cells in vitro was almost
diminished.
Based on these results, we postulated that a sufficient overall basicity and
linear architecture may be favorable prerequisites for an efficient and cell-
compatible gene carrier, respectively. Using a parallel synthesis approach,
we synthesized a series of low molecular weight lPEIs (lmw lPEI) with
relative number average molecular weights (Mn) between 1 and 8.1 kDa by
the cationic ring-opening polymerization of 2-ethyl-2-oxazoline and acid-
catalized hydrolysis of the corresponding poly (2-ethyl-2-oxazoline).
Depending on the complexation medium used, lmw lPEIs condensed pDNA
under the formation of nanoparticles between 100 nm and a few
micrometers, irrespective to the molecular weight of the polyamine or
Nitrogen / Phosphate ratio (Ratio of the polyamine-Nitrogen to the
phosphates of the nucleic acid: N/P ratio) applied. Polyplexes built with lPEI
of 8.1 kDa and lPEI 5 kDa exhibited an enhanced transfection efficacy and
improved cell compatibility, compared to the standard lPEI 25 kDa- and bPEI
25 kDa-derived transfection systems. However, we observed that a high lPEI
Mn led to a high polymer as well as polyplex cytotoxicity.
In order to design gene carriers of high efficacy and low cytotoxicity, we
cross-linked low molecular weight lPEI by reducible disulfide linkages,
leading to a series of polymers, that differed by the molecular weight of the
lPEI component (2.6 and 4.6 kDa), the linker type, and linker / lPEI ratio. The
cross-linked lPEIs formed polyplexes between 200 and 2500 nm with pDNA,
which were destabilized in the presence of disulfide reducing agents. The
efficacy of gene transfer to CHO-K1 and the cell compatibility after
transfection was improved several-fold compared to the corresponding linear
or branched PEI 25 kDa - pDNA complexes, modulated by the lPEI
molecular weight, the linker / lPEI ratio, and the N/P ratio applied.
To enable an in vivo application of the gene carriers, we synthesized a series
of methoxy poly (ethylene glycol) (mPEG) - lmw lPEI copolymers. All mPEG -
lmw lPEI copolymers condensed pDNA under the formation of nanoparticles
between 150 and 420 nm, showed a similar potential to impair ion-induced
particle aggregation, and showed a reduced non-specific internalization of
polyplexes by CHO-K1 cells.
The series of polyamines were used to identify the most promising
derivatives. The combination of the single classes of polymers will allow for
the manufacture of tailor-made non-viral vectors optimized to the specific
therapeutic concept or laboratory application.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Der Transfer von Genen wurde in den letzten Jahren zu einer wichtigen Arbeitstechnik in der Forschung und mag zukünftig auch als Therapiekonzept Anwendung finden. 1995 wurde das verzweigte Polyethylenimin (PEI) als vielversprechender nicht-viraler Genträger eingeführt. Aufgrund der niedrigen Transfektionseffizienz und eminenten Zytotoxizität findet jedoch bisher noch keine breite Anwendung. ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Der Transfer von Genen wurde in den letzten Jahren zu einer wichtigen
Arbeitstechnik in der Forschung und mag zukünftig auch als Therapiekonzept
Anwendung finden. 1995 wurde das verzweigte Polyethylenimin (PEI) als
vielversprechender nicht-viraler Genträger eingeführt. Aufgrund der niedrigen
Transfektionseffizienz und eminenten Zytotoxizität findet jedoch bisher noch
keine breite Anwendung. Ziel dieser Arbeit war das Design, die Synthese und
Charakterisierung von PEI-basierten Genträgern und deren Polyamin-DNA-
Komplexen zur Entwicklung effizienter und zell-kompatibler in vitro plasmid
DNA (pDNA: pEGFP-N1 Reporterplasmid) Transfer Systeme.
Wir haben per-N-methyliertes lineares (lPMEI) und verzweigtes
Polyethylenimin (bPMEI) durch die N-Methylierung der jeweiligen PEI 25 kDa
synthetisiert. Die entsprechenden Polyamin - pDNA Polyplexe besaßen eine
vergleichbare Partikelgröße, Oberflächenladung, endosomolytische Aktivität
und wurden in vergleichbarer Menge von CHO-K1 Zellen internalisiert. Sie
waren weniger zytotoxisch als PEI - pDNA Komplexe, verloren jedoch auch
ihre Gentransferaktivität.
Davon ausgehend, dass für eine hohe Transfektionseffizienz und niedrige
Zytotoxizität eine ausreichende Basizität und lineare Polymerstruktur
grundlegend sind, haben wir eine Serie linearer Polyethylenimine (lPEI) mit
relativen zahlenmittleren Molmassen zwischen 1 und 8,1 kDa synthetisiert.
Lineares niedermolekulares Polyethylenimin wurde dabei in einem
Parallelsyntheseansatz durch die Ringöffnungspolymerisation von 2-Ethyl-2-
oxazolin und anschließender Hydrolyse der resultierenden Poly (N-
acylethylenimine), erhalten. In Abhängigkeit vom verwendeten
Komplexierungsmedium, jedoch unabhängig von der Molmasse des
Polyamins oder N/P-Verhältnisses, bildeten sich mit pDNA Polyplexe einer
Partikelgröße zwischen 100 nm und einigen Mikrometern.
lPEI 8,1 und 5 kDa - pDNA Polyplexe zeigten in vitro eine höhere
Transfektionseffizienz und verbesserte Zellkompatibilität im Vergleich zu
Standard lPEI- und bPEI 25 kDa - pDNA Vectoren. Mit zunehmendem
Polymerisationsgrad des Polyamins stieg jedoch die Zytotoxizität des
Polymers und der entsprechenden Polyplexe an.
Um Transfektionsreagenzien herzustellen, die die niedrige Zytotoxizität
niedermolekularer PEIs mit der hohen Effizienz höhermolekularer PEIs
verbinden, haben wir eine Serie Disulfid-quervernetzter lPEIs synthetisiert.
Die Polymere unterschieden sich in der Molmasse der lPEI-Komponente (2.6
and 4.6 kDa), dem verwendeten Disulfid-Linker und dem stöchiometrischen
Linker / lPEI - Verhältnis. Die quervernetzten lPEIs bildeten mit Plasmid-DNA
200 bis 2500 nm große Polyplexe, die ihre Kompaktheit und Partikelgröße in
der Gegenwart von Reduktionsmitteln veränderten. Diese
Transfektionsreagenzien erreichten eine um ein Vielfaches höhere
Transfektionseffizienz und Zellkompatibilität als die vergleichbaren lPEI 25
kDa- oder bPEI 25 kDa - pDNA Polyplexe. Beide Größen waren dabei
abhängig von der lPEI-Molmasse, dem Linker / lPEI - Verhältnis und dem
verwendeten N/P-Verhältnis.
Um die Grundlage für eine in vivo Anwendung dieser Transfektionssysteme
zu schaffen haben wir eine Reihe von Methoxypolyethylenglycol (mPEG) -
lPEI Copolymere synthetisiert. Alle verwendeten Copolymere komplexierten
Plasmid-DNA und formten Nanopartikel mit einer Größe zwischen 150 and
420 nm, zeigten eine geringe Tendenz zur Partikelaggregation und wurden
nur vereinzelt von CHO-K1 Zellen unspezifisch aufgenommen.
In allen Serien wurden die Polymere mit den für ihre Anwendung besten
Eigenschaften ermittelt. Ihre Kombinierbarkeit ermöglicht es
maßgeschneiderte non-virale Vektoren herzustellen, die optimiert werden
können für ein bestimmtes therapeutisches Konzept oder ihre Verwendung
im Labor.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 12:54
Nur für Besitzer und Autoren: Kontrollseite des Eintrags
Downloadstatistik