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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-134194
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.13419
Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
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Open Access Art: | Primärpublikation |
Datum: | 2 Juli 2010 |
Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
Tag der Prüfung: | 24 Juni 2009 |
Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
Stichwörter / Keywords: | HIV, Impfstoff, Gag-Proteine, Vakzine, GagPolNef, CD40L, Env, GagPolNef, HIV-1, Vaccine, CD40L, Env |
Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
Status: | Veröffentlicht |
Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
Dokumenten-ID: | 13419 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Als Ausgangspunkt dieser Arbeit dienten die klinischen Studien EuroVacc01 und 02, bei denen gezeigt werden konnte, dass das getestete 97CN54 GagPolNef (GPN) Konstrukt in Kombination mit 97CN54 Env gp120 zwar gute Env-spezifische, aber nur in geringerem Umfang Gag-, Pol- und Nef-spezifische polyfunktionelle Antworten auf T-Zellebene induzierte. So waren die Studien hinsichtlich der Induktion ...
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Zusammenfassung (Deutsch)
Als Ausgangspunkt dieser Arbeit dienten die klinischen Studien EuroVacc01 und 02, bei denen gezeigt werden konnte, dass das getestete 97CN54 GagPolNef (GPN) Konstrukt in Kombination mit 97CN54 Env gp120 zwar gute Env-spezifische, aber nur in geringerem Umfang Gag-, Pol- und Nef-spezifische polyfunktionelle Antworten auf T-Zellebene induzierte. So waren die Studien hinsichtlich der Induktion Env-spezifischer Immunantworten ein Erfolg, hinsichtlich GPN wäre ein balancierteres Verhältnis der T-Zellantworten wünschenswerter gewesen.
In dieser Arbeit sollte das GPN Konstrukt weiterentwickelt werden, um vor allem die in den Studien beobachteten schwachen Gag-spezifischen T-Zellantworten zu verstärken, ohne die Env-spezifischen Immunantworten zu beeinträchtigen.
Die Modifikationen des Ausgangskonstrukts sollten i) die Wiederherstellung des Myristylierungssignals, ii) des viralen, ribosomalen Leserastersprungs und iii) der Aktivität der viralen Protease umfassen, um Partikelfreisetzung und Prozessierung des GPN-Polyproteins zu ermöglichen. Durch die verstärkte Freisetzung von GPN Partikeln sollte vor allem über cross-presentation die Immunogenität gesteigert werden.
Während der Herstellung des modifizierten Konstrukts wurde festgestellt, dass das 97CN54 Pr55gag nicht in der Lage war, virus-ähnliche Partikel (VLP) zu bilden. Nach einem Aminosäurensequenzabgleich mit dem Gag des 97CN001 Virus, welches derselben Patientenprobe entstammt wie 97CN54, wurden 7 Aminosäuresubstitionen identifiziert, welche die Partikelbildung beeinträchtigen könnten. Aus diesem Grunde wurde das 97CN54 Gag im Konstrukt durch 97CN001 Gag ersetzt. Im Anschluss konnten die geplanten Konstrukte generiert werden, welche die gewünschten Eigenschaften aufwiesen.
In Immunisierungsstudien mit Balb/C Mäusen wurde dann gezeigt, dass durch die Resubstitution des Myristylierungssignals am N-Terminus des Polyproteins und das Einfügen eines ribosomalen Leserastersprungs das GPN in seinen immunologischen Eigenschaften deutlich verbessert ist. Aufgrund einer nichtbeschriebene Punktmutation in der viralen Protease, welche deren Funktion inhibierte, verzögerte sich die Herstellung des Konstrukts mit aktiver viraler Protease und konnte nicht mehr in Immunisierungsstudien getestet werden. Ein weiterer wesentlicher Aspekt dieser Arbeit war die Generierung eines kodonoptimiertes 97CN001 Gag und eines 97CN54 PolNef Konstrukts, mit denen sich bei Immunisierungen verschiedenste Kombinationen, wie unterschiedliche Mischungsverhältnisse oder räumlich bzw. zeitlich getrennte Vakzinierungen, analysieren ließen. Zudem konnten nun 97CN001 Gag basierte VLP zu produziert werden, was mit dem ursprünglichen 97CN54 Gag aufgrund der ungenügenden Partikelbildung nicht möglich war. Dies eröffnet neue Optionen für künftige Immunisierungsstudien.
Desweiteren konnten neue Impfstrategien für eine Koimmunisierung von 97CN001 Gag bzw. GPN mit 97CN54 Env gp120 DNA getestet werden, um eine beobachtete immunologische Konkurrenz von Gag- und Env-spezifischen CD8+ T-Zellantworten zu vermeiden. So ließen sich bei einer räumlichen Trennung der Env gp120 von der Gag/Pol Vakzinierung bzw. einer Reduktion der applizierten Menge an Env gp120 DNA deutlich bessere Gag-spezifische CD8+ T-Zellantworten als bei einer äquimolaren Koapplikation induzieren.
Hinsichtlich der Entwicklung einer CD40L Variante als molekulares Adjuvans wurde erfolgreich eine membranständige Version des oligomeren MegaCD40L generiert. Diese Variante (MCD40L-MB) konnte auf der Oberfläche von VLP verankert werden und erwies sich im Aktivierungs- und Proliferationsexperiment mit murinen B-Zellen als fast ebenso so stimulatorisch wie wildtyp CD40L (wtCD40L) bzw. teilweise stimulatorischer als der lösliche, rekombinant hergestellte MCD40L. In einer ersten Immunisierungsstudie mit 97CN54 Env gp145 pseudotypisierten VLP wurden multivalente Immunantworten gegen Gag und Env untersucht. Jedoch konnten hier weder seitens wtCD40L noch seitens des MCD40L-MB deutliche Adjuvanseigenschaften bezüglich der Induktion spezifischer zellulärer und humoraler Antworten gemessen werden. Dies konnte auf die zu geringen Mengen an CD40L in den VLP Präparationen zurückgeführt werden.
In einer auf 97CN001Gag/97CN54 Env gp145 Plasmid-DNA basierten Immunisierungstudie konnte ein positiver Einfluss des MCD40L auf die Induktion von Env-spezifischen CD8+ T-Zell und humoralen Immunantworten gezeigt werden. So ließ sich beobachten, dass eine Adjuvierung mit MCD40L zwar die Env-spezifischen Antworten verstärkt, die Gag-spezifischen CD8+ T-Zell Antworten hingegen abgeschwächt wurden. Dennoch konnten Strategien über die Dosierung des MCD40L erschlossen werden, um optimale Gag- und Env-spezifische Immunantworten induzieren zu können.
In dieser Arbeit konnten also nicht nur verbesserte Immunogene und mögliche Kandidaten für molekulare Adjuvantien entwickelt werden, sondern auch verbesserte Strategien, diese im Rahmen von Immunisierungen applizieren zu können.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
As initial point for this work served the results of the clinical EuroVacc 01and 02 studies, in which the tested 97CN54 GagPolNef construct in combination with 97CN54 Env gp120 induced in humans good Env-specific but only to a lower extent Gag-, Pol- and Nef-specific, polyfunctional T-cell responses. Regarding the induction of strong Env-specific responses the studies were successful; regarding ...
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Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
As initial point for this work served the results of the clinical EuroVacc 01and 02 studies, in which the tested 97CN54 GagPolNef construct in combination with 97CN54 Env gp120 induced in humans good Env-specific but only to a lower extent Gag-, Pol- and Nef-specific, polyfunctional T-cell responses. Regarding the induction of strong Env-specific responses the studies were successful; regarding Gag-Pol-Nef a more balanced ratio of the T-cell responses was preferable. Especially strong Gag-specific responses are of interest to a HIV-1 Vaccine, because those are important for control of the HI viremia by the immune system.
Aim of this work was to improve the existing GagPolNef construct, especially to enhance the in the studies observed weak Gag-specific responses without hampering the Env-specific responses. Following modifications of the original construct were introduced: i) restoration of the myristylation signal, ii) the viral ribosomal frame shift and iii) restoration of the activity of the viral protease in order to enable particle release and the processing of the GagPolNef polyprotein. Especially the immunogenicity should be improved by cross-presentation of GagPolNef virus-like particles driven by an enhanced release.
After the introduction of the modifications into the constructs an inability of the 97CN54 Gag to form virus-like particles was detected. After an amino acid alignment with the Pr55gag of the HIV-1 viral clone 97CN001, an isolate from same blood sample as 97CN54, revealed the substation of seven amino acid substitions, which may influence the particle formation. So the 97CN54 was replaced by the 97CN001 Pr55gag. Subsequent the planned GagPolNef constructs, which contained the desired properties like improved particle release, the ribosomal frame shifting and an active viral protease were generated.
Immunisation studies in Balb/C mice showed, that the resubstition of the myristylation signal at the N-terminus of the polyprotein and the introduction of a ribosomal frame shift improved the immunogenicity. Because of a non published point mutation within the viral protease, which inhibited its function, the generation of this construct delayed and was not tested in an immunisation study.
Another important aspect of this work was the generation of a codonoptimized 97CN001 Gag and a 97CN54 PolNef construct. With these several combinations like different mixing ratios or spatially separated vaccinations were analyzed. Besides now 97CN001 Gag virus-like particles (VLP) can be produced, which was not possible with 97CN54 Gag. This enables new options for future immunisation studies.
Further vaccination strategies for co-administrations of 97CN001 Gag respectively GagPolNef DNA with 97CN54 Env gp120 were tested in order to avoid an observed immunological competition of Gag- and Env-specific CD8+ T-cell responses.
The spatial separation of the Env gp120 from the Gag/PolNef immunisations respectively a reduction of the co-administered amount of Env gp120 resulted in enhanced Gag-specific CD8+ T-cell responses in regard to the equimolar co-administration.
Regarding the development of a CD40L variant as molecular adjuvant a membrane bound version of the oligomeric MegaCD40L was successfully generated. This variant (MegaCD40L-MB) was anchored on the surface of Gag VLP. In an activation/proliferation assay with naϊve B-lymphocytes from Balb/C mice its activity was comparable to the wildtype CD40L (wtCD40L) and to some extent more stimulatory than the soluble, recombinant MegaCD40L. In a first immunisation study with 97CN001 Gag VLP pseudotyped with 97CN54 Env gp145 immune responses against Gag and Env were measured. Herein neither by the wtCD40L nor by the MegaCD40L-MB an adjuvant effect on the cellular and on the humoral level was measurable. This might rely on the low amounts of CD40L within the VLP preparations.
In an immunisation study based on 97CN001Gag / 97CN54 Env gp145 Plasmid DNA a positive impact of the MegaCD40L upon the induction of Env-specific CD8+ T-cell and humoral responses was measurable. Besides, the Env-specific responses were enhanced by the MegaCD40L, but the Gag-specific CD8+ T-cell responses were depleted. Despite of this, strategies for the dosage of MegaCD40L were evolved to induce optimal Gag- and Env-specific immune responses bypassing the immunological competition of the CD8+ T-cell responses aforementioned.
Besides the development of improved immunogens and possible candidates for molecular adjuvants also improved strategies for their application in immunisations were accomplished within this work.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 09:57