Fluorimetric and mass-spectrometric methods for analysis of GTP-converting signal-transducing proteins and enzymes

URN zum Zitieren dieses Dokuments:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-167536
DOI zum Zitieren dieses Dokuments:: 10.5283/epub.16753

Spangler, Christian

Vorschau

Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen mit Print on Demand
PDF
(1MB)

Veröffentlichungsdatum dieses Volltextes: 12 Okt 2010 07:58

Details

Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	12 Oktober 2010
Begutachter (Erstgutachter):	Prof. Dr. Roland Seifert
Tag der Prüfung:	24 September 2010
Institutionen:	Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik
Themenverbund:	Nicht ausgewählt
Stichwörter / Keywords:	Fluoreszenz, HPLC-MS/MS, GTP
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	16753

Vorschau

Bibliographische Daten exportieren

Zusammenfassung (Englisch)

Zusammenfassung (Englisch)

Background
Guanosine 5’-triphosphate (GTP) serves a central substrate of a diverse set of proteins and enzymes which are involved in specific signaling pathways in both eukaryotes and prokaryotes. These pathways are responsible for a variety of different cellular functions and the involved proteins and enzymes can play a key role in the development of dangerous diseases.

Fluorescence Assay for Ras Proteins
Mutated Ras oncogenes are involved in the progress of cancer. A luminescence-based microwell plate assay for real-time monitoring of the GTPase activity of wildtype and mutated Ras proteins was established. The emission intensity of the applied lanthanide complex quickly responds to changes in analyte concentration. The activity of various Ras proteins and the influence of a regulator as well as of a downstream effector was examined. The presented assay can serve as a cheap, easy, and robust platform for high-throughput screening of regulators affecting the GTPase activity of Ras proteins.

HPLC-MS/MS Assay for Di-Guanylate Cyclases
The formation of bacterial biofilms is the major cause of many chronic infections. Cyclic 3’:5’-di-guanosine monophosphate (c-di-GMP) is a ubiquitous second messenger in bacteria and is involved in the regulation of biofilm formation. A highly specific and sensitive HPLC-MS/MS method was developed and applied to the determination of the in vitro activity of the di-guanylate cyclase (DGC) PleD* and the in vivo quantitation of c di GMP in bacterial liquid cultures at different stages of growth. In Escherichia coli, intracellular c-di-GMP concentrations change in a growth dependent manner. Thus, the established quantitation method can serve as a valuable tool to gain more detailed insights into the complex c-di-GMP regulatory system.
Most chronic infections such as in the airways of patients with cystic fibrosis result from the formation of robust bacterial biofilms which are resistant to antimicrobial treatment due to the complex biofilm architecture. DGCs synthesize c-di-GMP which, at high concentrations, induces biofilm formation. Hence, DGCs represent pharmacological targets for potential inhibitors of c-di-GMP synthesis. The affinities of 2’(3’)-O-(N-methylanthraniloyl) (MANT)- and 2’,3’-O-(2,4,6-trinitrophenyl) (TNP)-substituted nucleotides to the model DGC YdeH from Escherichia coli were examined in fluorescence-based competition assays. Relative affinites were determined using the established HPLC-MS/MS method. The presented fluorescence-based assay can be used to initially screen potential DGC inhibitors even with low affinities.

Conclusions
In conclusion, this work describes the development and application of two novel analytical methods for the analysis of GTP-converting proteins and enzymes and demonstrates the advantages and disadvantages of each method. However, the choice of the appropriate method for a specific scientific question can essentially contribute to the elucidation of the complex signaling networks based on the conversion of GTP.

Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)

Hintergrund
Guanosine-5’-triphosphat (GTP) stellt ein wichtiges Substrat einer Gruppe verschiedenster Proteine und Enzyme dar, die sowohl in Eukaryoten als auch in Prokaryoten mit spezifischen Signaltransduktionswegen in Verbindung stehen. Diese Signalwege sind für eine Vielzahl verschiedener zellulärer Funktionen verantwortlich und die beteiligten Proteine und Enzyme können eine zentrale Rolle bei der Entstehung gefährlicher Krankheiten spielen.

Fluoreszenzassay für Ras-Proteine
Mutierte Ras-Onkogene sind an der Entwicklung von Krebs beteiligt. Es wurde ein Lumineszenz-basierter Mikrotiterplattenassay zur Echtzeit-Bestimmung der GTPase-Aktivität von Wildtyp- und mutierten Ras-Proteinen aufgebaut. Die Emissionsintensität des eingesetzten Lanthanoidkomplexes spricht schnell auf Änderungen der Analytkonzentration an. Die Aktivität verschiedener Ras-Proteine und der Einfluss eines Regulators sowie eines nachgeschalteten Effektors wurden untersucht. Der dargestellte Assay kann als preiswerte, einfache und robuste Plattform für das Hochdurchsatzscreening von Regulatoren, die die GTPase-Aktivität beeinflussen, dienen.

HPLC-MS/MS-Assay für Di-Guanylatzyklasen
Die Bildung bakterieller Biofilme ist die Hauptursache vieler chronischer Infektionen. Zyklisches 3’:5’-Di-guanosinmonophosphat (c-di-GMP) ist ein universeller second messenger in Bakterien und ist an der Regulation der Biofilmbildung beteiligt. Es wurde eine hochspezifische und sensitive HPLC-MS/MS-Methode entwickelt und für die Bestimmung der in vitro-Aktivität der Di-guanylatzyklase (DGC) PleD* und die in vivo Quantifizierung von c-di-GMP in Bakterien-Flüssigkulturen bei verschiedenen Wachstumsphasen angewandt. Bei Escherichia coli ändern sich die intrazellulären c di GMP-Konzentrationen in Abhängigkeit vom Wachstum. Auf diese Weise kann die entwickelte Quantifizierung als wertvolle Methode eingesetzt werden, um detailliertere Einblicke in das komplexe System der c-di-GMP-Regulation zu erhalten.
Die meisten chronischen Infektionen, wie bei Mukoviszidosepatienten, beruhen auf der Bildung robuster bakterieller Biofilme, die aufgrund der komplexen Biofilmarchitektur resistent gegen konventionelle Antibiotika sind. DGCs bilden c-di-GMP, das bei höheren Konzentrationen die Biofilmbildung induziert. Folglich stellen DGCs hochinteressante pharmakologische Zielstrukturen für potentielle Inhibitoren der c di GMP-Synthese dar. Die Affinitäten von 2’(3’)-O-(N-Methylanthraniloyl) (MANT)- und 2’,3’-O-(2,4,6-Trinitrophenyl) (TNP)-substituierten Nukleotiden zur Modell-DGC YdeH aus Escherichia coli wurden in fluoreszenz-basierten Kompetitionsassays untersucht. Relative Affinitäten wurden mit Hilfe der etablierten HPLC-MS/MS-Methode bestimmt. Der dargestellte Fluoreszenz-basierte Assay kann zum Screening von DGC-Inhibitoren benutzt werden, auch wenn diese nur relativ niedrige Affinitäten aufweisen.

Schlussfolgerungen
Abschließend kann man festhalten, dass in dieser Arbeit mehrere analytische Methoden zur Analyse GTP-umsetzender Proteine und Enzyme eingeführt wurden und dass jede Methode sowohl Vor- als auch Nachteile mit sich bringt. Wenn jedoch eine angemessene Methode für eine spezielle wissenschafltliche Fragestellung ausgewählt wird, kann man zur Aufklärung der komplexen Netzwerke der Signalweiterleitung, die auf dem Umsatz von GTP basieren, entscheidend beitragen.

Nur für Besitzer und Autoren: Kontrollseite des Eintrags

Downloadstatistik

Weitere Literatur (mittels CORE)

Details

Vorschau

Bibliographische Daten exportieren

Zusammenfassung (Englisch)

Zusammenfassung (Englisch)

Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)

Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)

Downloadstatistik

Downloads

Weitere Literatur (mittels CORE)

Universitätsbibliothek