| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen mit Print on Demand (12MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-186714
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.18671
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 18 Januar 2011 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Michael Thomm und Prof. Dr. Herbert Tschochner und Prof. Dr. Robert Weinzierl |
| Tag der Prüfung: | 11 Oktober 2010 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) > Prof. Dr. Michael Thomm |
| Themenverbund: | Nicht ausgewählt |
| Stichwörter / Keywords: | Transkription, transcription, Archaea, TFB, TFIIB, Initiation, B-Linker, B-Reader, RNA-polymerase, Initiationskomplex, initiation complex, TFE, Backtracking, Pol II, RNAP, transcription factor B, Transkriptionsfaktor B |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 18671 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Transkriptionsmaschinerie von Archaeen ist am nächsten verwandt mit, und eine vereinfachte Version der RNA-Polymerase II (Pol II) Maschinerie von Eukaryoten. Bei der Initiation der Transkription nimmt der hochkonservierte Transkriptionsfaktor (II)B sowohl in Archaeen (TFB) als auch in Eukaryoten (TFIIB) eine zentrale Rolle ein. In dieser Arbeit wird ein neues Modell für den Ablauf der ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Transkriptionsmaschinerie von Archaeen ist am nächsten verwandt mit, und eine vereinfachte Version der RNA-Polymerase II (Pol II) Maschinerie von Eukaryoten. Bei der Initiation der Transkription nimmt der hochkonservierte Transkriptionsfaktor (II)B sowohl in Archaeen (TFB) als auch in Eukaryoten (TFIIB) eine zentrale Rolle ein. In dieser Arbeit wird ein neues Modell für den Ablauf der Transkriptionsinitiation präsentiert, welches die Ergebnisse i) einer Pol II-TFIIB Strukturanalyse von S. cerevisiae (Labor Patrick Cramer, Genzentrum, LMU München), ii) einer Funktionsanalyse komplementärer Mutationen in TFB und rekonstituierter RNA-Polymerase (RNAP) von P. furiosus und iii) einer in-vitro- und in-vivo-Charakterisierung von Hefe-TFIIB-Mutanten integriert.
Die bereits bekannten N- und C-terminalen Domänen von TF(II)B, B-ribbon (Zink-Ribbon) und B-Core, werden von zwei erstmals beschriebenen strukturellen Elementen namens B-reader und B-linker verbunden. Im Komplex mit Pol II, formt der B-reader von TFIIB nicht wie bislang angenommen nur eine Schleife („B-Finger“), sondern anfangs eine alpha-Helix gefolgt von einem mobilen Loop in der DNA-bindenden Spalte (Cleft) der RNAP. Ebenfalls in der Cleft befindet sich der B-linker, welcher ein beta-Faltblatt mit der als Rudder bezeichneten Schleife in der Cleft bildet und sich als alpha-Helix parallel zur Cleft, senkrecht entlang eines Coiled-Coils (a8 und a9 in RNAP Untereinheit Rpb1/ A‘) an der Cleft Innenseite fortsetzt.
Im Anschluss an die Bindung der RNAP durch TF(II)B an den Promotor wird durch die RNAP die DNA im Bereich des Transkriptionsstarts aufgeschmolzen (Bildung des offenen Komplexes). Über KMnO4-Footprints und Transkriptionsversuche an Heteroduplex-Matrizen wird im P.-furiosus-System nachgewiesen, dass sowohl der B-linker von TFB als auch die Coiled-Coil-Struktur der RNAP für die Bildung des offenen Komplexes essentiell sind. Die Integrität der B-linker helix scheint entscheidend zu sein, da eine Prolin-Substitution einer konservierten Aminosäure (L92) in dieser alpha-Helix die Promotoröffnung verhindert, die Verwendung von Heteroduplex-Matrizen jedoch die Transkriptionsaktivität wiederhestellt.
Im offenen Komplex ist der kodogene DNA-Strang in der DNA-bindenden Spalte der RNAP gebunden. In vitro Trankskriptions- und KMnO4-Footprintinganalysen belegen, dass der B-reader von TFB für die effiziente Initiation unerlässlich ist, da er die Öffnung der Transkriptionsblase bis hin zum stromabwärts Ende einschließlich des Transkriptionsstarts ermöglicht. Die hier durchgeführte detaillierte Mutationsanalyse von TF(II)B erlaubt es, die Funktion im Stabilisieren des stromabwärts Endes der Transkriptionsblase einem konservierten Arginin (P. furiosus R57, S. cerevisiae R78) an der vermuteten Spitze des mobilen B-reader loops zuzuschreiben, welche wahrscheinlich mit dem Transkriptionsstart interagiert. Die B-reader helix hingegen vermittelt über Seitenketten, die in Richtung des transkribierten DNA-Stranges orientiert sind, die Erkennung eines konservierten Thymins sieben bis acht Basen stromaufwärts des Hefe-Transkriptionsstarts.
Außerdem werden Untersuchungen zum Backtracking-Status von gestellten Elongationskomplexen von P. furiosus gezeigt. Diese erlauben die eindeutige Interpretation der DNA-Protein-Crosslinking-Ergebnisse von Sebastian Grünberg, welche eine Umlagerung der Untereinheit H beim Übergang von Initiation zu Elongation implizieren. Die Analyse eines Elongationskomplexes durch TFS-induzierte RNA-Spaltung sowie Kartierung des RNA-3‘-Endes relativ zum aktiven Zentrum der RNAP durch Fe2+-Spaltung schließen Backtracking in den für die Crosslinking-Versuche verwendeten Elongationskomplexen aus. Die beobachteten Crosslinks von H nahe des aktiven Zentrums sind demnach nicht auf eine Rückwärtsbewegung der RNAP, sondern tatsächlich auf eine Transkriptionszyklus-abhängige Umlagerung dieser Untereinheit zurückzuführen.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The archaeal transcription machinery is most related to, and a simplified version of the RNA polymerase II (Pol II) transcription machinery in eukaryotes. During initiation of transcription, the highly conserved transcription factor (II)B plays a central role in archaea (TFB) and eukaryotes (TFIIB). This work presents a novel model for the mechanism of transcription initiation, integrating i) a ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The archaeal transcription machinery is most related to, and a simplified version of the RNA polymerase II (Pol II) transcription machinery in eukaryotes. During initiation of transcription, the highly conserved transcription factor (II)B plays a central role in archaea (TFB) and eukaryotes (TFIIB). This work presents a novel model for the mechanism of transcription initiation, integrating i) a novel Pol II-TFIIB cystal structure of S. cerevisiae (Group of Patrick Cramer, Gene Center, LMU Munich), ii) a functional analysis of complementary mutations in TFB and reconstituted RNA polymerase (RNAP) of P. furiosus and iii) an in vitro and in vivo characterization of yeast TFIIB mutants.
Two novel structural elements in TFIIB, the B-reader and B-linker, connect the previously identified N-terminal B-ribbon (Zinc-ribbon) structure with the C-terminal B-core domain. In the pol II-TFIIB structure, the B-reader does not form a single loop (“B-finger”), but instead consists of an alpha-helix followed by a mobile loop in the DNA binding cleft of the RNAP. The B-linker is positioned in the cleft as well, where it forms a beta-sheet with cleft loop rudder and an alpha-helix that runs in parallel to the cleft and perpendicular to a coiled coil structure (a8 and a9 in RNAP subunits Rpb1/A’) at the inner surface of the cleft.
Upon RNAP recruitment to the promoter with the aid of TF(II)B, the RNAP melts the DNA around the transcription start site (open complex formation). KMnO4 footprinting and transcription assays on heteroduplex templates in the P. furiosus system show, that both the B-linker element of TFB and the coiled-coil structure of the RNAP are essential for open complex formation. The integrity of the B-linker helix seems to be necessary for open complex formation, as substitution of a conserved residue (L92) by proline within this alpha-helix completely abolishes promoter opening, while transcription activity with this mutant is restored using a heteroduplex template.
In the open complex, the coding DNA strand is bound within the DNA binding cleft of the RNAP. In vitro transcription tests and KMnO4 footprints reveal that the B-reader is responsible for efficient initiation because it promotes DNA-melting until the downstream end of the transcription bubble including the transcription start site. The detailed mutational analysis shown here allows specifying the residue in charge of stabilizing the downstream end of the transcription bubble (P. furiosus R57, S. cerevisiae R78). Presumably this is due to interaction of the putative tip of the B-reader loop with the transcription start site. In contrast, residues of the B-reader helix pointing towards the template DNA strand in the cleft mediate recognition of a thymine eight or seven nucleotides upstream of the transcription start site conserved in yeast promoters.
Furthermore, the backtracking state of stalled elongation complexes of P. furiosus was investigated. The data shown here allow the unambiguous interpretation of DNA-protein crosslinking results obtained by Sebastian Grünberg, which suggest a repositioning of subunit H during the transition from initiation to elongation. TFS induced RNA cleavage and mapping of the 3’ RNA end relative to the active site using Fe2+-cleavage confirms that backtracking does not occur in elongation complexes used for the crosslinking experiments. This indicates, that crosslinking of RNAP subunit H nearby the active site in elongation complexes is not due to retrograde movement of the RNAP but indeed occurs because of transcription cycle dependent repositioning of this subunit.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 07:55
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