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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-215707
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.21570
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 12 Juli 2012 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer und Prof. Dr. Ralf Wagner |
| Tag der Prüfung: | 7 Juli 2011 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Themenverbund: | Nicht ausgewählt |
| Stichwörter / Keywords: | zellfreie Proteinsynthese, S30 extract, RNA Chaperone, Escherichia coli, in vitro Translation, Proteinexpression |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 21570 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Die zellfreie Proteinsynthese hat sich in den letzten Jahren zu einer wichtigen Methode der Proteinexpression entwickelt, die viele Vorteile gegenüber der in vivo Expression von Proteinen bietet. Ein Grund, warum die zellfreie Proteinsynthese die in vivo Expression noch nicht als Standardmethode zur Herstellung rekombinanter Proteine abgelöst hat, ist in der vergleichsweise geringen Produktivität ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die zellfreie Proteinsynthese hat sich in den letzten Jahren zu einer wichtigen Methode der Proteinexpression entwickelt, die viele Vorteile gegenüber der in vivo Expression von Proteinen bietet. Ein Grund, warum die zellfreie Proteinsynthese die in vivo Expression noch nicht als Standardmethode zur Herstellung rekombinanter Proteine abgelöst hat, ist in der vergleichsweise geringen Produktivität dieser Systeme zu finden. Intensive Bemühungen der letzten Jahre konnten zwar die Ausbeute der zellfreien Proteinsynthese stark erhöhen, dennoch sind die erzielten Mengen noch weit von dem entfernt, was theoretisch möglich sein könnte. Aus diesem Grund wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Ansätze verfolgt, die Ausbeute der zellfreien Proteinsynthese, am Beispiel eines Systems, das auf S30 Extrakten von Escherichia coli basiert, zu erhöhen. Darüber hinaus sollte dieses System als Teil eines von der GENEART AG entwickelten in vitro Evolutionssystems eingesetzt werden.
Zu Beginn wurde ein Protokoll zur Herstellung der S30 Extrakte und zur Durchführung von zellfreien Proteinsynthesereaktionen optimiert, um ein solides und modernes Testsystem für weitere Versuche zur Verfügung zu haben. Dabei konnte sowohl der Zellaufschluss durch Sonifikation, als auch die Präinkubationsmethode als kritische Einflussfaktoren der Syntheseleistung identifiziert werden. Auch zeigte sich die Verwendung eines RNase E-defizienten E. coli Stammes für die Herstellung der Extrakte, sowie die Erhöhung der Konzentration an DTT in der Synthesereaktion als förderlich für die erzielten Proteinausbeuten. Insgesamt führten die Optimierungen zu der Etablierung eines Systems, dessen Produktivität nun sowohl mit den Systemen anderer Autoren, als auch mit kommerziell erhältlichen vergleichbar ist.
Das optimierte zellfreie Proteinsynthesesystem sollte als Teil eines in vitro Evolutionssystems eingesetzt werden, wobei unter Anwesenheit der S30 Extrakte die Produktbildung einer reversen Transkriptase, die essentiell für eine Amplifikationsreaktion dieses Systems war, inhibiert wurde. Intensive Untersuchungen führten zu dem Schluss, dass zu viele Proteine in den S30 Extrakten, wie beispielsweise RNasen und DNA Polymerasen, dafür verantwortlich sind. Der Einsatz isolierter Ribosomen unterschiedlicher Reinheit war nicht möglich, da Translationsaktivität und Produktbildung der reversen Transkriptase nicht vereinbar schienen.
Im Zusammenhang der Erhöhung der Produktivität konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Translationsmaschinerie in den S30 Extrakten optimal rekonstituiert ist. Dazu testete man alle Faktoren des Translationsapparates einzeln auf ihren Einfluss auf die Synthese eines Testproteins. Es wirkten sich jedoch nur die Elongationsfaktoren Tu und Ts positiv aus, wobei die Erhöhung der Syntheseleistung mit 13% bzw. 6% jedoch zu gering ausfiel, um von limitierenden Faktoren zu sprechen. Darüber hinaus wurden auch zellfreie Proteinsynthesereaktionen mit geringeren Konzentrationen an Translationsfaktoren durchgeführt. Jedoch konnte auch hier keine Steigerung der Syntheseleistung erzielt werden. Dies, zusammen mit den obigen Ergebnissen, erlaubt die Aussage der optimalen Rekonstitution der Translationsmaschinerie in S30 Extrakten von Escherichia coli.
Desweiteren behandelte diese Arbeit das Problem der Sekundärstrukturbildung der mRNA, das mehrere Autoren als Grund für eine limitierte Proteinausbeute sehen. Durch den Einsatz der verschiedensten RNA Chaperone der unterschiedlichsten Klassen wurde versucht, auf die Translation inhibitorisch wirkende Sekundärstrukturen der mRNAs aufzulösen und diese Limitation zu überwinden, wodurch jedoch keine Steigerung der Syntheseleistung erreicht werden konnte. Die erstmalige Verwendung einer miRNA in einem zellfreien System, die durch Hybridisierung mit der 5‘ untranslatierten Region der mRNA regulatorische Sequenzen freilegen sollte, führte zu einer etwa 13%igen Steigerung der Syntheseleistung.
Die größten Steigerungen der Syntheseleistung des zellfreien Systems aus E. coli erreichte man in dieser Arbeit durch die Erniedrigung der Reaktionstemperatur, wodurch unerwünschte Nebenreaktionen reduziert werden sollten. Dabei war der Einsatz der 5‘ untranslatierten Region eines Kälteschockgens nötig, um bei niedrigeren Temperaturen eine effiziente Proteinsynthese zu gewährleisten. Die Auswirkungen dieser 5‘ untranslatierten Region auf die zellfreie Expression mehrerer Proteine wurde getestet, wobei bei 60% sowohl eine erhöhte Ausbeute, beispielsweise 20% im Falle der Chloramphenicol Acetyltransferase, als auch eine einheitliche optimale Expressionstemperatur von 25°-30° C festgestellt werden konnte.
Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit mehrere vielversprechende Ansätze identifiziert werden, die Syntheseleisung von zellfreien Proteinsynthesesystemen aus E. coli zu verbessern, sowie einige bedeutende Hinweise zum besseren Verständnis dieser Methode geliefert werden.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In recent years, cell-free protein synthesis has emerged as an important method for protein expression, featuring many advantages compared to in vivo expression techniques. The relatively low productivity of cell-free systems is responsible for in vivo expression still being the standard method for the production of recombinant proteins. Although in recent years intense efforts could raise ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In recent years, cell-free protein synthesis has emerged as an important method for protein expression, featuring many advantages compared to in vivo expression techniques. The relatively low productivity of cell-free systems is responsible for in vivo expression still being the standard method for the production of recombinant proteins. Although in recent years intense efforts could raise protein yields of cell-free protein synthesis systems dramatically, these systems are still far from producing theoretically possible amounts of protein. For this reason, different approaches were followed in this work to increase protein yields of cell-free protein synthesis using a system based on S30 extracts of Escherichia coli as an example. Furthermore, this system should become part of an in vitro evolution system, developed by the GENEART AG.
First of all, a protocol for the production of S30 extracts and the performance of cell-free protein synthesis reactions was optimized providing a solid and modern test system for further experiments. Thereby, cell lysis by sonification, as well as the method of preincubation could be identified to be critical for protein yields. Also, the use of an RNase E deficient E. coli strain for extract preparation and the increase of DTT concentrations during protein synthesis reactions showed positive effects on protein yields. Taken together, these optimizations resulted in the establishment of a test system comparable with commercially available systems or systems of other authors.
The optimized cell-free protein synthesis system should become part of an in vitro evolution system, whereby presence of S30 extracts inhibited the product formation of a reverse transcriptase essential for an amplification reaction of the evolution system. Great efforts revealed that this inhibition was due to many proteins in the S30 extracts, like RNases and DNA polymerases. Even the use of isolated ribosomes of different purity was not possible, because translational activity and product formation of the reverse transcriptase seemed inconsistent.
Regarding the productivity of cell-free systems, this work could show, that the translation machinery in the S30 extracts is optimal reconstituted. Therefore, every single factor of the translational apparatus was tested on the influence of the synthesis of a test protein. Only the elongation factors Tu and Ts were able to raise protein yields, whereby the increase of 13% and 6%, respectively, was too low to speak of limiting factors. Furthermore, cell-free protein synthesis reactions were carried out with lower concentrations of translation factors. Here too, no improvement of protein yields could be achieved. As mentioned above, these results provide strong evidence of an optimal reconstituted translation machinery in S30 extracts of Escherichia coli.
Moreover, this work gives attention to the problem of mRNA secondary structure formation as a reason for limited protein yields, as mentioned by several authors. By the use of different RNA chaperones of diverse classes it was tried to dissolve mRNA secondary structures inhibiting translation to overcome this limitation, whereby no improvement of protein yields could be achieved. The use of a miRNA for the first time in a cell-free system, that should uncover regulatory sequences of the mRNA by hybridizing with the 5’ untranslated region, could increase protein yields by 13%.
In this work, the major increase in protein yields of the E. coli cell-free system was achieved by a reduction of reaction temperatures to reduce unfavorable side reactions. Thereby, the use of the 5’ untranslated region of a cold-shock gene was necessary to ensure efficient protein synthesis at low temperatures. The impact of this 5’ untranslated region was tested on the cell-free expression of several proteins, whereby 60% showed enhanced protein yields, e.g. 20% for the chloramphenicol acetyltransferase, as well as a standardized optimal expression temperature of 25°-30° C.
Taken together, this work provides several promising approaches to increase protein yields of cell-free protein synthesis systems as well as several important informations for a better understanding of this method.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 06:19
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